免疫组化结果判断及常见问题的分析解读.pptVIP

嗜酸性粒细胞中细胞色素显色 吞噬细胞内 含铁血黄素 坏死组织着色：AE1/AE3 坏死组织着色 交叉反应：乳腺ki-67组织细胞胞浆着色 黑色素瘤，细胞内含黑色素，呈紫黑色，HE染色 灶状着色：机械原因着色 Cyclin D1 套细胞淋巴瘤 全片着色 全片着色 边缘着色 “阴阳脸”着色 气泡 非特异性着色原因 对策 操作过程冲洗不充分 每步冲洗3×5min 内源性过氧化物酶 3％H2O2封闭 内源性生物素 使用生物素阻断试剂盒阻断 电荷吸附 非免疫动物血清封闭 抗体不纯 采用单克隆抗体 切片制片不当 改善取材和制片 加试剂后切片干燥 防止切片干燥 非特异性着色及其对策 无信号片 CD30 2. 染色的假阴性及其对策 染色假阴性原因 对策 组织处理不当（固定、浸蜡） 改善条件，重取材 一抗与二抗种属连接错误 确定抗体种属无误 抗体失效 不得使用过期的试剂盒 显色系统不相适配 更换适配的显色系统 操作不当，遗漏重要步骤 严格遵守操作规程 无色或浅色片 MCL理想的 CD5着色。所有的瘤细胞都着色很强。散在的T细胞着色比瘤细胞深。 MCL的CD5染色不足 (一抗浓度太低)。 MCL瘤细胞几乎都没有着色。 3. 染色过弱原因及其对策 染色过弱原因 对策 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高浓度，延长时间 滴加试剂时缓冲液未沥干 滴加试剂前沥干多余水分 过度蛋白封闭 缩短封闭时间 抗原被破坏 新鲜组织及时固定，固定时间不要超过24小时 室温太低，15℃ 适当延长孵育时间 * * * * * * 免疫组化结果判断及常见问题分析 肝脏：CK8理想着色，胆管上皮细胞强阳性， 肝细胞呈不同层次阳性。 pan CK（AE1/AE3） 在肝脏理想的染色，采用了热修复。 肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。 一、特异性染色的判断 1.特定的定位 细胞阳性——根据靶抗原不同而呈现胞膜型、胞浆型 或胞核型 间质阳性——表现为细胞外着色，局限性或弥散性 2.染色的不均一性 阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布 染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少 3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。 4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。 免疫组化标准化照片 CK10 CD44v6 ER 合格的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提不合格的免疫组化染色切片容易导致误判 C-erbB-2 优 良 中 差 4 3 2 1 ER 子宫内膜PR染色，修复不足 子宫内膜PR染色，修复良好 PR 编号 阳性片 待检片 阴性对照 结论 1 2 3 4 5 － ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ － ＋ － － － 操作失误，抗体失效 非特异性着色 阳性片不含靶抗原 待检片不含定位抗原 待检片含定位抗原 二、染色结果的判断 PCNA S-P×400 S-P×400 1-day CM 4-day CM 阳性强度 　20×10视野下，随机选取5个视野，测100个阳性细胞的平均光密度即为此片的阳性强度。 三、结果分析 P53 阳性细胞百分比 计数100个瘤细胞，其中阳性细胞的比例： ＜5% （－） 5%~30% （＋） 30%~50% （ ＋ ＋ ） ＞50% （ ＋ ＋ ＋ ） PCNA Barnes法 A：瘤细胞显色有无及深浅 0（不着色） 1（浅黄色） 2（棕黄色） 3（棕褐色） B：显色细胞的比例 1（1%~10%） 2（11%~50%） 3（51%~80%） 4（＞80%） 评分=A×B 0分：阴性 1~4分：弱阳性 ＞4分：强阳性 胶原染色 阳性面积百分比 40×10视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考面积的百分率。 CD34 Weidner法（MVD计数） 孤立的棕黄色细胞族代表一条微血管。 低倍镜下找到组织内密度最高区域。 40×10视野下计数微血管数目。 K-ras VEGF 附：定量分析——图象处理系统 1、图象处理： 利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征进行测量。 2、图象处