第二章工业发酵菌种选育要点.ppt

优缺点 1、同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，保藏期长，一般达5～15年， 2、存活率高，变异率低，较理想。 3、除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物均适用。 4、操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。 4、液氮超低温保藏法 简称液氮法。 原理：在超低温（－130℃）状态下所有的代谢活动停止而生命延续。 将预保存的菌种加入以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂中制成菌悬浮液封于安瓿瓶中，经控制降温速度的冻结后(－35℃)，贮藏在（－150～-196℃）液氮罐内。 抗生素筛选 初筛可以变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。 摇床复筛 降解纤维素产生产透明圈 复筛 复目的是确认符合生产要求的菌株。 以质为主，应该精确测定每一个菌株的生产指标。一般在摇瓶、小型发酵罐上进行。 筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。 初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 二、诱变育种 突变：由于染色体或基因本身的变化而产生 遗传性状的变异。 表型迟延：表型改变落后于基因型改变的现象。 （一）、诱变剂的作用原理 各种诱变的机制 1.诱变育种的主要环节 紫外线 出发菌株 含诱变剂的液体培养基 接种 接种分离 选择优良突变株 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂 物理在：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 { （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择 压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH 诱变育种方案设计 诱发突变 常用诱发剂及其特点 诱变剂的选择 　　不稳定菌株－－－－温和诱变剂 稳定菌株－－－－强烈的、广谱的诱变剂 低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性 物理诱变剂 　　紫外线、X-射线、 γ-射线、 快中子 　　特点：紫外线方便、有效、使用安全，其他的几种射线有一定的穿透力 化学诱变剂 　　碱基类似物、吖啶类、烷化剂 　　特点：高效、经济、但应注意使用安全 诱变育种步骤 出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选 出发菌株的选择 1. 选择纯种 2. 平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅 度不同，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值 之差要小。 3. 有良好的代谢特性 4. 选择对诱变剂敏感的菌株。 5. 选用多个出发菌株进行诱变收效较较快。 诱变剂的选择 野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。 遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。 要考虑诱变剂的作用机理来选择诱变剂，两种诱变剂复合使用效果好。 最适剂量(有2种观点)： 1.杀菌率90%－99%较好，甚至 99.9%; 2.杀菌率75%－85%。 突变株的筛选（Selection） 随机筛选 (Random selection) 摇瓶筛选法 初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。 ????????????????? 复杂、耗时??????????? 琼脂块筛选法 　 简单、快速，但不准确 自动化筛选（筛选几千个菌落数/天） 生物工程的三个主要环节是菌种选育、发酵和提炼。其中以菌种的影响最大。 抗生素 投产时的产量(u/ml) 中期产量(u/ml) 目前估计产量(u/ml) 提高倍数 青霉素 20（1943年） 8000（1955年） 85000 4250 链霉素 50 （1945年） 5000（1955年） 35000 700 金霉素 200 （1949年） 4000（1959年） 20000 100 诱变育种 诱变育种的一般步骤以合适的诱变剂(物理及化学诱变剂)处理大量而均匀分散的细胞悬液(单细胞或单孢子),在引起绝大多数细胞死亡的同时,使存活个体中碱基变异频率大幅度提高.