1-1DNA重组技术的基本工具介绍.ppt

基 因 工 程 第一节DNA重组技术的基本工具 一. 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性核酸内切酶 二. DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶 三. 基因转移工具（“分子运输车”） ——基因进入受体细胞的载体 ⒉ 种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。 3.作用特点 ⒈主要来源： ⒉种类与命名： ⒊作用特点（特异性） 4.限制酶识别序列 5.作用结果： 3. 种类：（1）E·coliDNA连接酶 （2）T4DNA连接酶 　 ⒈ 运载体必备的条件： 　　⑴在受体细胞中能自我复制并稳定保存 　　⑵有1个至多个限制酶切割位点 ⑶有特殊的标记基因，便于鉴定和选择 　　⑷对受体细胞的生存无决定性作用 ⒉ 常用运载体： 　 ⑴质粒 　 ⑵λ噬菌体的衍生物 ⑶动植物病毒 * 专题1 基因工程的概念 基本过程 操作水平 操作对象 操作环境 基因工程的别名 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？ 噬菌体侵染细菌的实验。 思 考： 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 基础理论 艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 基础理论 沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 基础理论 梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 基础理论 克里克等提出中心法则 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 逆转录 复制 科技探索之路 基础理论 1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 1)1967年基因转移载体的发现 2)1970年工具酶的发现 3)1977年DNA合成和测序技术的发明 4) 1972年DNA体外重组的实现 5)1973年重组DNA表达实验的成功 6)1980年第一例转基因动物问世 7)1988年PCR技术的发明 基础理论和技术发展催生了基因工程 ⒈主要来源： 主要从原核生物中分离纯化 思考 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。 练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens） SmaⅠ 大肠杆菌 （Escherichia coli R） EcoRⅠ （1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列 例如： 大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列， 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （2）在特定的位点切割DNA分子。 并在G和A之间切开。 ——特异性 限制酶的识别序列： 能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 “分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶) 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成 切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 产生黏性末端或平末端 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 4.作用结果： EcoRⅠ限制酶 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 SmaⅠ 平末端　　　平末端 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 被限制酶切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。 识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 主要从原核生物中分离纯化 产生黏性末端或平末端 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成 “分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶) ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… EcoRⅠ ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… 不