膜片钳技术原理及相关基本知识0306.ppt

膜片钳技术 1991 Nobel基金会的颁奖评语： 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 [K+]o [K+]i [Na+]o [Na+]i 电生理学研究简史： 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。 1912年，Bridge 确定了AP的“全或无”现象。同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel奖。 1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。 1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1μm的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。 Voltage clamp（电压钳技术）由Cole和Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。 1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10~100 GΩ的高阻封接(giga seal)，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。 History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了“通道”的概念。 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patch clamp)技术。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。 膜片钳技术 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流， 从而了解离子运输、信号传递等信息。 膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。 膜片钳技术 一、记录设备 首先，尽可能完善膜片钳记录设备是实验前的重要步骤，如用模型细胞测定电子设备、安装并测试应用软件、调节光学显微镜、检验防震工作台等。 二、微电极的制备 膜片钳电极是用外径为1-2mm的毛细玻璃管拉制成的。标准的毛细玻璃管(外经1. 5mm，管壁厚0.3mm)适合于制作单通道记录的微电极，而全细胞记录则应选管壁较薄(0.16mm)的毛细玻璃管，这样可以使电极阻抗较低。 膜片钳技术 三、封接(sealing)技术 封接(seal)是膜片钳记录的关键步骤之一。封接不好噪声太大必然影响细胞膜电信号的记录，一般要求封接阻抗至少20GΩ才可进行常规记录。为了形成良好封接必须保持清洁的溶液、良好的视野以及适当的电极镀膜。 为了获得较好的“千兆欧封接”，细胞表面必须裸露以便微电极尖端能接触细胞，细胞的大小也是成功记录的一个因素，一般选择10-20um的细胞比较理想。 膜片钳技术 全细胞膜片钳记录(whole-cell patch-clamp recording)是应用最早，也是最广的钳位技术，它相当于连续的单电极电压钳位记录，也就是说全细胞记录类似于传统的细胞内记录，但它具有更大的优越性，如高分辨率、低噪声、极好的稳定性以及能控制细胞内的成分等。全细胞记录技术测定的是一个细胞内全部激活通道的电流，