普通免疫学-6-2013-单克隆抗体.ppt

普通免疫学(Immunology) HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养。 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成核酸而死亡。 未融合的脾细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。 （1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 抗体稀释度应根据： ①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。 三、常见免疫分析方法 利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点。 免疫沉淀 1. 环状沉淀实验：是溶液中的沉淀反应。在体外当抗体与相应抗原二者浓度比例恰当时，会发生免疫沉淀。 免疫监测 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白 人绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫监测 尿液 胶乳 胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性 腺激素，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中 人绒毛膜促性腺激素的免疫监测-阴性对照 Co-IP工作示意图 Co-immunoprecipitation binding wash elution Y Y Y Y Y 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白 Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes 2.免疫双扩散 抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。双扩散是在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。 当两个抗原完全一致时，两条沉淀线完全融合；如果两个抗原无共同抗原决定簇时，沉淀线互不干扰；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺 3. 免疫电泳 利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特点与免疫扩散结合一起进行分析的方法。 1、 血清免疫电泳:双扩散 2、火箭电泳：为加速度的单向免疫扩散(抗原扩散,抗体不扩散)与电泳结合的一种方法 在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。 常用于标记抗原的放射性同位素有 3H、125I、131I、 14C等。3H可以置换有机化合物中的氢，不影响原有化学性质，且半衰期长和能量低，便于防护。 125I的敏感度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期，低能量的γ射线易于标记，标记物。 标记方法简便，多肽、蛋白质与小分子半抗原均可进行碘标记。一些不能直接用碘标记的半抗原，通过接上一个酪氨酸亦可用碘标记之。 氯胺T直接标记法。 　　氯胺T是一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125I的I－氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。 发光免疫分析 用发光物质标记抗体。根据发光物的来源不同,有化学发光(chemiluminessence)和生物发光(bioluminescence)：化学发光供能反应为一般化学反应。指某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。例如化学发光剂如荧光醇（luminol）发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当回到基态时，伴随光子的释放，发生化学反应。 用于标记的酶的种类: 碱性磷