相衬显微镜的基本介绍.docVIP

相衬显微镜(Phase contrast microscope) 在光学显微镜的改进过程中，相衬显微镜的制造成功和普遍的应用，是近代显微镜技术中的重要成就。在1935年荷兰学者泽尼克提出了相衬法原理，至1941年由德国蔡司工厂诞生了世界上第一台相衬显微镜。它的产生，使人类的视觉在光学显微镜下又得到新的扩展。从信息利用的角度来看，人们将它视为光学信息处理概念下的第一个产品，因而获得了1953年诺贝尔奖金。 我们知道，人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化的情况下，才能在显微镜下看到被检物体的存在，但活的生物体多是无色透明的，当光线通过时，波长和振幅变化不显著，这样在明场镜检下就难于观察清晰。为了克服这一困难，可以采用一定的措施，如物理、化学处理法、材料经固定、染色等过程，使被检物体的颜色及亮度发生变化，但这只能观察已被杀死的材料，而不能观察到活体状态；当然，缩小聚光镜的孔径光阑，以增加明暗反差的对比，但这样不能充分发挥物镜数值孔径的性能，细微结构仍难于被分辨，同时镜象亮度也随之降低；利用暗场、荧光或偏光镜检术，虽然能观察活体标本，但这些显微术都是利用不同的光学原理，达到特定的观察目的，镜检效果局限在一定范围内。可见上述措施都不能得到满意的镜检效果，而采用相衬显微术，则能解决上述问题，使无色透明活体标本的细微结构在相衬显微镜下变得清晰可见。 一、相衬显微镜的特点 相衬显微镜是利用被检物体的光程（折射率与厚度之乘积）之差进行镜检的方法。也即是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质亦成为清晰可见，这是普通显微镜难以达到的。这不仅大为便利了活体材料的观察，而且相衬显微术和 普通染色观察相结合，还可判断“膺象”和真实的图象。 相位和相位差 光的传播具有波动性质，波动的能以平衡位置为准，以一定的振幅反复振动而前进。光波通过光学均匀体时， 单位时间（T）内波动的能所达到的位置，便是它的“相位”。 如图4-2所示，有A、B两束光，其中A光束只经过单一介质（如空气）；而B光束在中途还通过一块透明玻璃，这样B光束使受到阻滞而速度减少。因此，A和B之间便产生了一定的相位差。 相位差和振幅差示意图 图4-2 在一定的介质内，波长决定了可见光的颜色，而振幅的大小则决定其亮度，这是为人眼所能分辨出的，但人眼不能分辨出相位差。因此，在普通显微镜下观察未经固定、染色的无色透明材料时，虽然被检物体各部分的折射率不同，并能使通过它的各组光线产生一定的相位差，也不能察觉出它们之间的差异，就是这个道理。图中的A光束和通过具有吸光物质的C光束之间，由于振幅的减少，使亮度减弱，则和A光束有着明暗的差别，这样就能为人眼所分辨。 光源射出的光线通过被检物体时，如果某部分完全是均质透明体，则光线将继续前进，称直射光；若某部分含有折射率或厚度不同的均质时，由于光的衍射现象则向周围侧方分散前进，这种光线称为衍射光。当直射光和衍射光两个光波达到一点时，则相互干涉，形成合成波。合成波的大小，取决于两个光波的振幅和相位差。如果振幅相等，相差为零，其合成波则有两倍的振幅，产生相长干涉（同向量），最为明亮；若一个光的相位推迟，其合成波减少，光度渐暗，当恰好推迟到半个波长（1/2λ）时，则两个光波相互抵消，合成波发生相消干涉（异向量），则成为黑暗状态。 二、相衬显微镜的装置 相衬显微镜因各厂家的制作形式不同，用法也略有各异，但其原理是相同的，在装置上都包括有：环状光阑、相板、中心（合轴）调整望远镜。 （一）环状光阑(Ring slit)：装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一整体——相衬聚光镜。它 是由大小不同环形光阑装在一圆盘内，外面标有10×、20×、40×、100×字样，相应地与不同倍率的物镜配合使用。老式的常为单一环状光阑，附加在视场光阑的上部，它的大小依聚光镜下面安装的调节透镜来进行调节。 （二）相板(Phase plate)：在物镜的后焦点平面处装有相板，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫“共轭面”；另一是通过衍射光的部分，叫“补偿面”有相板的物镜称“相衬物镜”，外壳上常有“PH”字样。 相板上镀有两种不同的膜——吸收膜和相位膜，吸收膜常为铬、银等金属在其真空中蒸发而镀成的薄膜，能把通过它的光线吸收60~93%，可分为透过率为7%、15%、20%、40%四个档级。因此，分高（HIGH略写H）、中（Medium略写M）、低（Low略写 L）及低低（Low-Low略写LL）四类。这样可根据被检物体的特性而加以选择应用。现将相衬物镜的选择方法列表于下。 负相衬Negative contrast (N) 正相衬Positive contrast(P) 适用于物体的形态、数量及活体情况的观察 适用于物质内部细