发酵工程_2工业用微生物菌种.pptVIP

5 菌种初筛和复筛 初筛：从大量分离出来的菌株中选出几株好的 平板筛选：粗放，快速。 eg. 筛选生产某一种水解酶的菌株 摇瓶发酵筛选: 接近发酵罐培养条件 eg. 筛选抗生素菌株 复筛：对菌株生产能力进行精确测定 工业菌种的育种目标 提高目标产物产量 提高目标产物纯度，减少副产物（例：产黄青霉不产色素） 改良菌种形状，改善发酵过程（不产表面活性剂，即泡沫） 获得新的产品（基因工程菌产干扰素） 选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。 2. 诱变育种 定义：用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 优点：大幅提高突变频率（自然突变率很低） 缺点：非定向。 对出发菌株的要求：产量高、对诱变剂敏感、变异幅度大 物理诱变剂 紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体。一般实验室、中小型工厂适用，也很安全。 X—射线、γ—射线：电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。 化学诱变剂 碱基类似物：5-溴尿嘧啶 烷化剂：EMS 移码突变剂：溴乙锭，丫啶类 使用化学诱变剂的优缺点： 1、就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂很经济的，只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂。 诱变菌株的筛选 筛的过程很重要，why？ 1 黑箱式操作。诱变是随机的，筛选是定向的。 2 由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。 初筛：以量为主。eg.平板筛选 复筛：以精确度为主。 eg.高通量筛选 3. 杂交育种 3. 杂交育种 4. 原生质体融合 1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出 特点 (a)杂交频率较高（相比传统的杂交育种）：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 (b)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 步骤 1)带稳定标记的亲本菌株。 2)原生质体制备。 3)等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4)涂布于再生培养基，再生出菌落。 5)选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6)生产性能筛选。 （1）带稳定标记的亲本菌株。 营养缺陷型 抗药性菌株 抗性基因 (2)原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 细菌（肽聚糖） ：溶菌酶 霉菌（纤维素，几丁质）：纤维素酶、溶壁酶 酵母（葡萄糖，几丁质）：蜗牛酶 (3)原生质体的融合 PEG促细胞膜流动，促进融合 5. 基因工程育种 基因工程育种： 运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达。 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 １、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。 例：类血红蛋白基因工程菌 1 从透明颤菌中，用该基因引物，PCR，获得该基因。（知道该基因序列，请公司直接合成） 2 构建重组质粒 3 电转技术转到感受态宿主细胞中 4 筛选 5 鉴定阳性重组子 众多功能 1 提高产量 目的基因多拷贝 2 廉价原料利用基因 3 新功能 4 减少副产物 出芽短梗霉生产A+B，敲除合成B的酶 5 缩短生长周期 放线菌的基因转到大肠杆菌，或者直接把基因组变小。 6 减少二氧化碳排放 将二氧化碳引入一条代谢途径消化掉 7 稳定性提高 质粒型表达-整合性重组技术，转到受体菌染色体组中 8 品质改善 …… 6. 代谢工程的定义 利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。 又称作途径工程，是多基因的基因工程。  代谢工程发展基础 代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。 代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。 根据节点下游分支的可变程度，节点分为： 柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。 半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时