同源克隆剖析.pptVIP

50μl反应体系 10×PCR Buffer（Mg2+-free）:5μl MgCl2(15mM):3μl dNTP(10mM):0.6μl 5/-Primer(10μM):0.5μl 3/-Primer(10μM):0.5μl DNA模板：10-250ng Taq DNA polymerase:1-2U ddH2O: 加至 50μl 100μl反应体系 10×PCR Buffer: 10μl MgCl2(15mM): 10μl（1.5-2.5mM） dNTP(10mM): 10μl(各为200μΜ) 5/-Primer(10μM): 1μl（0.1-0.5μΜ） 3/-Primer(10μM): 1μl（0.1-0.5μΜ） Taq DNA polymerase(5.0U/μl）：3-5U 基因组DNA模板： 10-250ng ddH2O: 加至 100μl 94℃ 2-5min 94℃ 30-40s 退火温度 1min 25-40cycles 72℃ 1-2min 72℃ 7-10min 4℃ 保存 PCR反应条件 PCR反应条件的选择 1.初变性：94℃5min。 2.预变性：94℃30-45s。 3.退火：退火温度（55-72℃）一般选择比理论Tm低5-10℃（常用5℃左右）。 4.延伸：一般为70-75℃（常用72℃），扩增长度为1-2kb时延伸时间为1min，大于2kb时可适当延长至5-10min，引物长度小于16bp，可采用使延伸温度缓慢上升到70-75℃，在最后一轮循环后在70-75℃(72℃)延伸10min。 5.循环数：25-30个循环。 常用的PCR反应条件 94℃初变性5min，94℃30s、55℃30s、 72℃1min，25-30个循环，72℃10min后4℃停止反应。 木奈PPO基因保守区片段的PCR产物 cDNA末端的快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE） 5/-RACE 5/RACE引物设计 1.GC含量大于50%，退火温度大于58°C 2. 3/端不能以A结尾 3.GSP1尽可能靠近poly(A) 4.GSP2与GSP3之间的间隔至少大于50bp 5. GSP2、GSP3与AUAP不能在3/端有4个以上的互补配对 6.扩增cDNA全长应在ATG上游设计5/端引物，在终止密码子的下游设计3/端引物 7.GSP1、GSP2、GSP3均为反向基因特异引物 8.一般两个正向引物AAP与AUAP，AAP与GSP2配对，AUAP与GSP3配对 AAP与AUAP的序列 AAP的序列： 5/-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3/。 AUAP的序列： 5/-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3/。 5/RACE的全过程 cDNA第一链的合成：在PCR管中加入GSP12.5pmol、总RNA1-5μg ，无RNA酶水加至15.5μl，混匀，放70℃水浴保温5min，放冰上冷却后，离心；依次加入10X PCR buffer 2.5μl、25 mM MgCl22.5μl、10 mM dNTP mix 1μl、0.1 M DTT2.5μl总体积为24μl混匀，离心；42°C保温1min，加入1μlSuperScript. II RT，混匀，离心； 42°C保温1hr；70°C 保温15 min，离心；放入37°C；加入1 μl RNase mix，混匀，离心；37°C保温30 min ，离心；-20°C保存 逆转录产物的纯化 预先将bingling solution放室温，将100μl无菌水放65°C预热；在逆转录产物中加入120μl bingling solution（6MNaI)；将混合物转到GLASSMAXspin cartridge中，13000g离心20s；取出柱子将离心管中的液体转入到新的离心管中保存，将柱子放回到原离心管中；向柱子中加入0.4ml 4°C预冷的1X wash buffer，13000g离心20s；去掉液体，重复洗3次；用400μl70%乙醇（ 4°C预冷）洗2次，去掉70%乙醇， 13000g离心1min；将柱子转移到新的离心管中加入50μl 65°C预热的无菌水，13000g离心20s洗脱cDNA。 cDNA的加尾反应 在离心管中依次加入无RNA酶