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* 分子克隆技术 华中农业大学生命科学技术院 李香花吴昌银基因操作原理 基因工程 分子克隆技术 任务： 将一个水稻DNA 片段从一个载体亚克隆到另一个载体上 水稻转基因植株的阳性鉴定及拷贝数检测 某基因转录水平的表达检测 重组DNA 筛选鉴定 分离外源基因 载体 重组 转化子 受体细胞 通过转化载体的构建实验掌握下列操作: 分子克隆 质粒载体的抽提，外源DNA的准备 琼脂糖凝胶电泳 DNA的质量检测 载体与外源DNA的限制性内切酶消化 (载体的去磷酸化或目的DNA片段的回收 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子的筛选、鉴定（挑克隆 - 抽质粒 - 测序） 酶切 PCR 扩增 cDNA 其它来源的DNA片段等 转基因水稻的外源基因的拷贝数检测 DNA抽提 DNA酶切 酶切产物电泳 转膜 烘膜 预杂交 探针准备及标记 杂交 洗膜/自显影 12 1 2 3 4 5 6 7 9 (kb) 1 2 3 35 转基因植物拷贝数检测 Southern Blotting 植物总DNA的抽提 植物总DNA质量检测 DNA的琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶操作 Southern 转移 探针的制备，分子杂交 同位素操作及及放射自显影等方面的操作技术 Southern杂交技术 通过该实验掌握： 基因表达分析 Northern Blotting RT-PCR Real Time PCR cDNA 芯片 Reverse Transcription PCR RNA抽提 cDNA 反转录 基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导 PCR Northern Blotting Northern Blotting 基因表达水平 基因特异引物 （梁大成等，2006） Northern Blotting 表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析 ladder c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 EI12I1 EI22F22 EI1K8 EI35I3 ?-actin A B C D E A: IRBB10 叶片接种 白叶枯（PXO86） C: C101A51 叶接种 稻瘟病（V86013） B: IRBB13 叶片接 种 白叶枯（PXO99） D: MH63 叶片接种 稻瘟病（V86013） E: MH63 叶片接种 稻瘟病（1366） （周斌，2001，硕士论文） 通过做RT-PCR，掌握： 植物总RNA的抽提 RNA电泳 mRNA的反转录 PCR技术等 分子克隆实验注意事项 在整个实验过程中都应严格遵守实验室的规章制度，不准违规操作仪器（损坏物品的赔偿制度 ） 离心机 ：平衡、离心管配套、转速 移液器：不能超量程使用，不能倒置，小心摔坏；吸取、打出试剂时动作应轻柔；用过的tip不能丢到桌面上，应直接放到废物杯中 对1.5ml,0.5ml 离心管的操作：手不能碰到内盖，不能对着打开盖子的离心管讲话 化学药品：腐蚀性、诱变剂、放射性物质 实验过程中和实验完毕注意水、火、电 保持实验室安静、清洁 实验考核：平时成绩＋实验报告＋考试成绩 *