分子生物学实验设计资料.pptVIP

?基于LSU基因和SSU基因的广义美味牛肝菌系统发育研究 姓名：李静娴 专业：生物工程 导师：马绍宾 学号：12015002274 一、研究背景 二、研究目的及意义 三、实验设计 四、数据分析 核糖体 DNA ( ribos omal DNA, r DNA)是国际上公认的生物各类群各分类水平比较研究的一个很好的分子指标 ,它是一类中等重复的 DNA序列 ,每个重复单位都由非转录间隔区、 转录间隔区和 3种 RNA ( 18SRNA, 5 . 8S RNA)基因编码组成.核糖体 DNA在细胞中以一种协同方式进化 ,在个体和群体内有着较好的均质性 ,因此个体的 rDNA通常具有种代表性 ,即少量个体的抽样亦能有效地代表其来源群体的 DNA变异情况。 目前,核糖体 DNA的转录间隔区 ITS区、 大亚基片断 LSU r DNA (即 28S RNA )以及小亚基片断SS U r DNA (即 18S RNA)等基因在原核生物研究中得到了广泛、 有效地应用，但在大型真菌鉴定中的应用较少。 其中 LSU r DNA虽然较 ITS区保守 ,但它较 SSU r DNA变异高 ,是一段由保守区与高变区相互镶嵌的 DNA片段,适合从种到属的分类鉴定。 一、研究概况 云南省具有复杂的地形地貌和特殊的气候条件以及多种多样的森林类型和土壤种类。在这样得天独厚的自然生态条件下，孕育了丰富多彩的食用菌资源。云南的野生食用菌加上人工栽培种类食用菌有800种左右，食用菌种类约占世界的约40%，占全国的85.3%左右；绝大多数属于口蘑科、牛肝菌科、红菇科、蘑菇科、裂褶菌科、多孔菌科、珊瑚菌科和丝膜菌科等类群。 其中牛肝菌类是云南市场上最为重要的食用菌。牛肝菌类有近40钟常见食用菌，主要分布有9属：牛肝菌属、疣柄牛肝菌属、绒盖牛肝菌属、圆孔牛肝菌属、小牛肝菌属、粉孢牛肝菌属、褶孔牛肝菌属、乳牛肝菌属和粉末牛肝菌属。滇中市场上以牛肝菌属为主，占总贸易量至少70%。牛肝菌类以美味牛肝菌、黑牛肝菌、褐疣柄牛肝菌最为常见,同时美味牛肝菌也是国际著名的食用菌,在欧洲国家深受欢迎,是出口创汇的重要种类之一。 一、研究概况 在云南，可食用的牛肝菌主要根据子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”，“黄牛肝”和“黑牛肝”，其中“白牛肝”即实际分类学上的“美味牛肝菌”在贸易中占有重要的地位。从分类学上看，广义的美味牛肝菌复合群包括以下5个种:美味牛肝菌(Boletus edulis Ball.ex Fr)、褐红牛肝菌(B.pinophilus Pilát Dermek)、铜色牛肝菌(B.aereus Ball.ex Fr)、网纹牛肝菌(B.Reticulates Schaeff)和夏生牛肝菌(B.aestivalis(Paul.)Fr)这5个种。  二、研究目的及意义 牛肝菌科(Boletaceae)真菌具有重要的生态和经济价值。云南省是美味牛肝菌最重要的主产区，但是由于近年来不合理的采收、生存环境的破坏以及人工栽培技术的滞后，使美味牛肝菌呈现出产量日益减少。要发展和壮大我国牛肝菌产业，使资源得到可持续利用，正确认识物种及其生物学特性是进行研究工作的基础。 目前针对牛肝菌属进行的分子系统学研究，多采用多个基因（3~4个）。综合利用多个基因序列、形态特征及生态特征进行联合系统发育分析，可得到较为准确的能反映牛肝菌属的种类多样性状况及系统发育关系的结果。 基于LSU和SSU的系统发育分析，国外和国内都很少有报道。本研究试图选取牛肝菌科中的广义美味牛肝菌属，选用LSU和SSU分析构建系统树。研究的主要目的一是分析牛肝菌的类群划分及类群下已知种间的关系，为羊广义美味牛肝菌菌属系统发育提供详实的分子证据。 三、实验设计 3.1实验材料 在野外调查时采集研究材料，新鲜牛肝菌采集后用硅胶干燥或自然风干后备用。 3.2实验仪器 电子天平；水浴箱；常温超速离心机；北京六一仪器厂电泳槽；Bio Rad电泳仪；WD-9403F型手持紫外分析仪；GE9700 PCR仪；Beckman UV640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪。 3.3 实验试剂 1×CTAB DNA提取液；TE缓冲液；氯仿；苯酚；异戊醇；异丙醇；β-巯基乙醇；乙酸钠；70%乙醇；76%乙醇；核酸染料；上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）；dNTP；DL2000Marker；DL5000Marker； MgCl2；10×Buffer；TapDNA聚合酶；NS1/NS8引物；LROR/LR5引物。 试验流程： LSU和SSU序列扩增引物设计 样品采集，编号 检测DNA浓度及纯度 CTAB法提取样品DNA PCR扩增 PCR体系参数的优化 DNA检测及琼脂糖凝胶DNA