DNA重组及重组DNA技术说课.ppt

重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面 疾病相关基因的发现与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组计划的完成 疾病的基因诊断和基因治疗 * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的分离获取——分 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA (见第20章) PCR法 (见第20章) 其他方法 (见第20章) 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T （二）载体的选择与构建——选 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 目的： ① 获得某一目的基因或DNA片段 ② 获得目的DNA片段所编码的蛋白质 载体 插入DNA片段 宿主细胞 质粒 5~10kb 细菌，酵母 λ噬菌体载体 ~20kb 细菌 黏粒 ~50 kb 细菌 BAC ~400kb 细菌 YAC ~3 Mb 酵母 不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞 （三）目的DNA与载体连接——接 方式：（1）单一相同黏端连接 （2）不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接 黏端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 单一相同黏端连接 不同黏端连接（定向克隆） Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头(linker)连接 通过其他措施产生黏端进行连接 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 +