细胞培养概述介绍.pptVIP

第一章 细胞培养概述 课程安排: 第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶，清毒的方式、压力与时间。 第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）；干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇床等相关设备。 第三次：细胞培养用液及培养液（基）：水的要求；平衡盐溶液（种类与配制）；消化液（种类与配制）；谷氨酰胺补充液；抗生素溶液的配制；培养基颜色要求与变化代表的意义；小牛血清的批号、灭活与分装；天然培养基；常见合成培养基种类、如何配制、分装与贮存。 第四次：细胞培养的基本技术：原代细胞分离（培养前准备、无菌操作的注意事项具体的流程）、培养（酶消化法和组织块培养法、如何计数、接种密度）。细胞生长状况的观察（培养液颜色与透明度的变化、细胞生长状况、细胞形态变化、微生物污染、体外培养细胞的生长类型、细胞培养中的常用术语）；培养细胞一代生长过程（分期及特点）；盖玻片条细胞培养法；细胞传代（消化酶、传代的比例、及注意事项）；冻存与复苏（冻存和复苏的原则：慢冻快融；冻存和复苏具体操流程）。细胞培养注意事项（如细胞污染判断、观察与处理原则）。 第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别；凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）；细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）；细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化，免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。 第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。 第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的流程和相关的指标）。 第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转染法和RNA干扰技术。） 第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植技术、显微操作技术） 第十次：参观与讨论： 主要参考书： 1. 《动物细胞培养技术》作者：程宝鸾，出 版 社：中山大学出版社 2．《细胞培养》 作者：司徒镇强，吴军正　出 版 社：世界图书出版公司 3. 《小鼠发育生物学与胚胎实验方法》作者： 金岩 出版社：人民卫生出版社 4. 《小鼠胚胎操作实验手册》 作者：安德拉斯. 纳吉 翻译: 孙青原 主要内容: 一、细胞培养发展史（略讲）: 二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）: 三、细胞培养实验室无菌的基本要求: 四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装和清毒): 一、组织培养发展简史（一）发展史 1878 Claude Bernard: 证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。? 1885 Wilhelm Roux: 首次采用了“Tissue culture”这个名词。? 1887 Ross Harrison: 利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了 Ross Harrison被称为细胞培养之父。? 早期培养 培养器材： Harrison（1906）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织细胞的基本模式的建立。 Carrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞的营养问题。 Strengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动物器官在体外的发育与功能作出贡献。 以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。 1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。 1951年Eagle 开发了能促进动物细胞体外培养的人工合成培养基。 1952 Gey 和同事： 分离培养了Hela细胞。? 1952 Dulbecco: 发明了