EMSA及杆状病毒基因敲除摘要.ppt

EMSA及杆状病毒基因敲除 杭州赫贝——专业医学实验外包服务 李海 EMSA 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术。 #1生物素标记目的DNA #2生物素标记目的DNA+结合 蛋白 #3未标记目的DNA+结合蛋白+生物标记目的DNA 原理：通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA复合物或RNA复合物比非结合的探针移动得慢。 步骤 1蛋白的准备 2探针的制备 3预电泳 4蛋白与探针孵育 5非变性电泳 6转膜 7压片 1：生物素标记阳性DNA；2：生物素标记的阳性DNA+DNA结合的蛋白3：生物素标记的阳性DNA+未标记竞争性阳性DNA+结合蛋白4：生物素标记的ppolh启动子序列5：生物素标记的ppolh启动子序列+纯化的orf61蛋白6：生物素标记的ppolh启动子序列+未标记的ppolh序列+纯化的orf61蛋白 优化参数 主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响 1抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解） 2结合蛋白的浓度 3探针的浓度 4非特异性探针的浓度 5缓冲液的配方和pH 6聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件 7保温时间和温度 8是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素） 杆状病毒基因敲除 RED重组技术 Red/ET重组是新近出现的一种基于λ噬菌体Red操纵子（Redα/Redβ/Redγ）和Rac噬菌体RecE/RecT重组系统的DNA工程技术。 通过该技术可以简单、快速地对任意大的DNA分子进行插入、敲除、突变等多种修饰，而且还可对长达80kb的DNA片段进行亚克隆。由于重组反应的整个过程都是在大肠杆菌细胞内部完成，因此不存在碱基突变危险。该技术已被广泛地用于基因组DNA，如细菌人工染色体、大肠杆菌染色体等的遗传修饰研究以及基因工程药物的研究和开发中。 原理：Red 同源重组系统由λ噬菌体exo、bet 、gam 三个基因组成,它们分别编码Exo 、Beta 、Gam 三种蛋白质。Exo 蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24 kD ,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA 分子, 另一端只可容纳单链DNA。Exo 蛋白可结合在双链DNA 的末端,从DNA 双链的5′端向3′端降解DNA ,产生3′突出端。 杆状病毒中的基因敲除和功能研究 1.构建打靶片段 2.构建基因敲除型病毒Bacmid（RED重组） 3.构建补回型病毒Bacmid（采用Bac-to-Bac系统）