DNA测序概述(全)资料.pptVIP

样品处理 文库制备 Flow Cell 固定 桥式扩增 测序 数据处理 总结 ABI —SOLiD测序技术 连接测序 连接酶 底物: 8 碱基单链荧光探针混合物。 1、2位的碱基：表征探针染料类型 3～5位的碱基：随机碱基 6～8位的碱基：可以和任何碱基配对的特殊碱基 第一轮：1、2；6、7；11、12；........ 第二轮：0、1；5、6；10、11；........ 第三轮：4、5；9、10；14、15；....... 第四轮：3、4；8、9；13、14；......... 第五轮：2、3；7、8；12、13；......... 五轮测序完成后，按照第0、1位，第1、2位...…的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列 读长25-35bp 样品处理 文库制备 连接磁珠 emPCR 反应板准备、上机测序 总结 第三代DNA测序技术 特点：高通量、单分子测序 1. Helicos公司 Heliscope单分子测序仪 基于边合成边测序的思想 将待测DNA随机打断成约200bp大小的片段 3’末端加上50bp带有荧光标记的poly(A) tail 文库变性形成单链 与芯片上固定的Oligo dT探针结合 利用poly(A)上的荧光标记进行精确定位 依次加入4种荧光染料标记的单核苷酸 在DNA聚合酶的作用下与模板互补配对并延伸一个碱基，ICCD相机采集荧光信号 通过化学剪切去除荧光基团并清洗，进行下一轮反应 读长25-30bp SMRT技术 SMRT技术基于边合成边测序的思想 以SMRT芯片为测序载体进行测序反应 SMRT芯片是一种带有很多ZMW（零模式波导）孔的厚度为100nm的金属片 2. Pacific Biosciences公司 ZMW ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，它阻止可见的激光（波长大约为600 nm）完全透过ZMW。激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮。在每个ZMW中，单个DNA聚合酶分子利用专利技术锚定在底部玻璃的表面。 最大读长为30Kb，平均读长约8.5Kb，是目前所有商品化测序仪中读长最长的 纳米孔测序技术是一种基于电信号测序的技术 以α-溶血素为材料制作的纳米孔，孔上有核 酸外切酶，孔内共价结合有分子接头环糊精。 被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳 米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过 纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅 度就成为每种碱基的特征。 3. Oxford Nanopore Technologies公司 DNA测序技术概述 第一代DNA测序技术 三测序方法的原理 第二代DNA测序技术 三个测序平台的工作原理及操作步骤 第三代DNA测序技术 单分子测序的特点及应用前景 自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代DNA测序技术 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期 1977年Sanger发明了双脱氧链终止法 同一时期, Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代 这些技术统称为第一代DNA测序技术 双脱氧链终止法 ddNTP没有3’羟基，在链的延伸过程中如果插入，就会终止链的延伸。 单链模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP 存在的反应体系中能合成双链。 如果这一反应体系中存在ddNTP，互补链合成过程就会终止于该ddNTP插入位点。 5ˊP P 5ˊ 3ˊHO OH 3ˊ 5ˊP OH 3ˊ P32 5ˊ 5ˊP OH 3ˊ HO DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP ddGTP ddATP ddTTP ddCTP 双脱氧链终止法 待测序的双链片段 制备单链DNA 加入反应体系 ddGTP ddATP ddTTP ddCTP 5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG 5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G 聚合产物分别在4个