免疫组化ICH.ppt

雌激素受体β在乳腺癌的表达 EJ细胞PCNA表达 EJ细胞CDK6表达 GFAP阳性神经胶质细胞 体外神经胶质细胞培养免疫组化GFAP阳性 培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 棕色(突触) 免疫组织化学及其应用 概 述 1．免疫组织化学概念 免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后，用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和对其进行研究。 2．免疫组织化学的相关理论和技术 2.1 免疫组织化学的工作原理 抗体与其抗原特异性结合 通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定位和含量。 2.2 免疫组织化学的全过程包括： 　　① 抗原提取和纯化 　　② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体） 　　③ 抗体效价检测和抗体纯化 　　④ 标记抗体 　　⑤ 细胞和组织切片标本的制备 　　⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 　　⑦ 观察和记录结果 抗体(antibody) 多克隆抗体(polyclonal antibody) 纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。 单克隆抗体(monoclonal antibody) 单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇（这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇）。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。 常用标记物 1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：①底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后，不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）、PE等。 3．生物素 与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。 2.3 免疫组织化学组织细胞处理 切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 石蜡组织切片中抗原性的修复： A、化学方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液 2.4 常用免疫组织化学方法： A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法 一、免疫荧光法 用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合，在荧光显微镜下观察，FITC呈现黄绿色荧光，代表所鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸收波长为490nm，最大发射波长为520nm。 免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。 二、免疫酶法 用酶标记抗体