反转录PCR介绍.ppt

转基因植物表达的RT-PCR检测 实验原理 　RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse transcription， RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA. mRNA cDNA PCR产物 一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。 RT-PCR—一步法和两步法 两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。 RT-PCR—一步法和两步法 外源基因的转录表达 基因表达 ?基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。 ?基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。 DNA RNA Protein 转录 翻译 目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法 1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、real-time PCR (RNA ） 反转录PCR(RT-PCR) mRNA cDNA PCR Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶 用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达 注意问题： 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度 仪器 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 试剂 RNA 反转录酶，3U/μL Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。 实验操作步骤： 1）RNA提取： 关键 防止RNA降解 RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。 2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物) 5’ AAAAAAAA3’ TTTTTTTT mRNA cDNA A）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分 总RNA 2μL（1-5μg） 10×PCR buffer 1μL dNTPmix（各2.5mM） 2μL 逆转录酶（200u/μL） 0.5μL Oligo（dT） 或randorm 9 mers 2μL ddH2O 至10μL 混匀后稍离心，42℃孵育30min，99℃ 5min然后4 ℃保温5min，终止反应后置冰上。 3) PCR 特异性引物、模板、Taq 聚合酶。 （B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20μL反应体系 10×PCR buffer（含MgCl2） 3μL 2.5mmol/L dNTP 2μL 10μmol/L Primer1 1μL 10μmol/L primer2