chapter转录调控与基因功能注释解说.pptxVIP

第 七 章;、基因转录调节的基本模式; 转录调控可以控制转录何时发生以及产生多少RNA。被RNA聚合酶转录的基因可被至少五种机制所调控： 特异性因子会改变RNA聚合酶对于特定启动子或一套启动子识别的特异性，使得RNA聚合酶更多或更少地结合到这些启动子上。 阻遏因子会结合到DNA链上的靠近或覆盖启动子区域的那些非编码序列上，阻碍RNA聚合酶顺利进入此链，故阻碍了基因的表达。 通用转录因子：这些转录因子将RNA聚合酶安放至编码蛋白序列的起始位置，继而释放聚合酶以转录mRNA。 激活因子增强RNA聚合酶与特定启动子的相互作用，促进基因的表达。激活因子通过增强RNA聚合酶对启动子的吸引而达到此作用，这一机制是通过与RNA聚合酶亚基的相互作用或间接通过改变DNA结构而实现的。 增强子是位于DNA螺旋结构上的一些位点，它们通过与激活因子相结合以将DNA弯曲使特定启动子朝向起始复合物。;二、 基因转录调节机制的研究方法;一、ChIP（染色质免疫沉淀）技术;Negative control;二、ChIP-chip技术; ChIP（染色质免疫沉淀）技术与芯片技术相结合后，产生了染色质免疫共沉淀-芯片技术（Chromatin Immunoprecipitation-chip, ChIP-chip）。免疫共沉淀结合微阵列技术可以在基因组范围内筛选蛋白结合靶点，成为深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。?? 一般来说，ChIP-chip分3步完成： ChIP：是在生理状态下把胞内蛋白质和DNA甲醛作用下交联在一起，用超声波打碎为0.2-2 kb的染色体小片段，然后通过目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，获得特异地作用于目的蛋白结合的DNA片段； DNA处理：通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。其中共沉淀的 DNA和合适的对照用荧光标记，加在载玻片上，用于芯片分析； 芯片分析：使用外源性DNA作为背景，免疫沉淀DNA与作为背景的对照进行比较，可以找到特异性蛋白在基因组中的结合位点。;1、样本交联和片段化，将DNA结合蛋白与DNA进行固定，形成蛋白:DNA复合物，然后超声片段化，一部分片段化后的染色质样品预留为对照Input样品，另一部分进行免疫共沉淀(称为IP样品); 2、免疫共沉淀，用特异抗体与蛋白:DNA复合物进行免疫共沉淀; 3、磁珠富集抗体:蛋白:DNA复合物，再洗脱; 4、用蛋白酶K消化抗体:蛋白:DNA复合物(IP)以及蛋白:DNA复合物(Input)，解交联后分离dna片段，并进行纯化; 5、取等量IP和Input样品进行WGA扩增，并对扩增产物进行纯化; 6、用Klenow酶进行标记(IP标记cy5+Input标记cy3)，并纯化定量; 7、芯片杂交，将标记好的IP样品和Input样品杂交到同一个点阵上; 8、芯片清洗及扫描; 9、图像采集及数据分析，利用IP/Input计算并确定peak，有显著意义的peak即为目标蛋白结合区域; 10、提交结果报告，常规内容包括芯片原始数据、目标蛋白结合位置以及基因注释。;三、ChIP-seq技术;ChIP-Seq的优势 具有碱基层面的分辨率； 不会有ChIP-chip中由DNA片段杂交导致的噪音，GC含量、片段长度、片段浓度以及耳机结构都会对杂交造成影响； ChIP-chip中的微阵列信号不是线性增长的，其所测量的范围有限。 由于在设计array时，探针的数量、种类有限，当coverage比较高的时候无法准确测量，也无法发现新的序列。;把细胞内的DNA与蛋白质交联（Crosslink）后裂解细胞，分离染色体 通过超声或酶处理将染色质随机切割，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来 再通过反交联（Reverse crosslink）释放结合蛋白的DNA片段， 最后测序获得DNA片段的序列。;实验设计的关键 抗体质量：一个灵敏度高和特异性高的抗体可以得到富集的DNA片段，这有利于探测结合位点。 样本量：Illumina，10-50ng DNA，需要用PCR进行扩增的轮数也比较少，因而由PCR导致的偏差比较小 空白对照：空白对照是必要的，存在很多假阳性情况，举例：1. 开放的染色体区域更容易被打断成片段，这样导致tag数在基因组上的分布是不均匀的;2.很多重复序列会使做map的时候得到结果难以解释。空白对照的用途：可以判断由ChIP-Seq得到的peak时候具有统计上的显著性。 三种类型的空白对照：1.部分进行免疫共沉淀前的DNA（input DNA），这是最常用的；2.由免疫共沉淀得到而不含有抗体的DNA(mock IP DNA)