外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测讲述.pptx

实验八：GFP在大肠杆菌中的诱导表达和检测 ;一．实验目的;二．原核表达的一般流程;原核表达：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： ——易于生长和控制； ——用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； ——有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 ——但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 ;表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： ——选择标志的编码序列； ——可控转录的启动子； ——转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； ——一个多限制酶切位点接头； ——宿主体内自主复制的序列。 ;pET载体系统;将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合