分子生物学检测解说.ppt

聚合酶链反应(PCR)技术 PCR发展简史 PCR基本概述 PCR基本原理 PCR发展简史 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 1993年，Higuchi等报道了实时PCR(real-timePCR) PCR基本概述 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 PCR基本原理 PCR扩增基本要素 PCR扩增过程 PCR扩增基本要素 PCR扩增参数 温度与时间参数 （1）变性温度与时间 （2）退火温度与时间 （3）延伸温度与时间 循环次数 PCR基本扩增过程 实时定量荧光PCR技术 实时荧光PCR基本原理 Taqman实时荧光PCR基本原理 双杂交探针实时荧光PCR基本原理 Taqman实时荧光PCR基本原理 双杂交探针实时荧光PCR基本原理  实时荧光定量PCR工作流程 标本的采集 标本的运送 标本的处理 基因扩增 扩增产物分析 标本的采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本采集的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染 PCR实验室设置 试剂准备区(Ⅰ区 ) 标本处理区( Ⅱ区 ) 扩增分析区( Ⅲ区 ) 产物分析区( Ⅳ区 ) 实时荧光定量PCR的应用我们福州PCR主要检测项目 1.乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA) 2 .人乳头瘤病毒HPV23型、人乳头瘤病毒6/11、人乳头瘤病毒16/18 3.沙眼衣原体DNA、解脲支原体DNA、淋球菌DNA 4.丙型肝炎RNA 乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测 乙型肝炎病毒(HBV)概述 乙型肝炎病毒基因区 乙型肝炎病毒临床意义 乙型肝炎病毒变异检测 乙型肝炎病毒(HBV)概述 乙肝病毒是已知最小的部分双链的环形DNA病毒，长3.2kb，有高度重叠的4个基因区，编码至少8种蛋白。即S基因编码的大、中、小HBs；C基因的前C、HBc、HBe；P基因的聚合酶和X基因的HBx。 乙型肝炎病毒基因区 S区 C区 P区 X区 乙型肝炎病毒临床意义 判断肝病的病情、预后和传染性 预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效 乙型肝炎病毒YMDD变异 YMDD: 酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸 YIDD 突变：蛋氨酸 异亮氨酸 YVDD突变：蛋氨酸 缬氨酸 人乳头瘤病毒（HPV）PCR检测 人乳头瘤病毒的概述 人乳头瘤病毒的型别与分布 人乳头瘤的致癌机理 人乳头瘤病毒检测的临床意义 人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系 理想的宫颈癌筛查 人乳头瘤病毒的概述 双链DNA无包膜病毒 环状DNA，约8Kb； 病毒颗粒直径为50～55nm； 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 游离在细胞内，持续存在，不引起任何病变，或引 起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生 等。而癌变则与病毒DNA整合入染色体密切相关。HPV 感染是否发病取决于被感染的细胞是否进行成熟分化。 人乳头瘤的型别与分布 型别 已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、33、35、39?、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等） 分布 有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52， 58 在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌 和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。 人乳头瘤病毒的致癌机理 HPV的基因结构 人乳头瘤病毒HPV的基因结构按功能可分为早期区（E区）、晚期区（L区）和非编码区（LCR）三个区