DNA和RNA取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分.doc

DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分： 第一部分：DNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分： 第二部分：DNA提取常见问题分析及对策 提取常见问题分析及对策 前言 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 是遗传信息的载体， 是遗传信息的载体 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 了进行测序、杂交和基因的表达， 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。 是非常重要的前提。 量和高纯度的 是非常重要的前提 DNA提取原则 DNA提取原则保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法染色体DNA的提取 染色体DNA的提取 DNA CTAB法 法 SDS法 SDS法 其它 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法非染色体DNA的提取 的提取 非染色体 质粒DNA的提取 的提取 质粒 ? 碱裂解法 ? 煮沸法 线粒体、叶绿体 线粒体、叶绿体DNA的提取 的提取 ? 差速离心结合 差速离心结合SDS裂解法 裂解法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 CTAB法原理（植物 提取经典方法） 法原理 植物DNA提取经典方法 提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 （ ， 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， ），是一种阳离子去污剂 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中（ 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 ）是可溶的， 抽提，去除蛋白、多糖、 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 出来。 溶液在低于15 时会形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 溶液在低于 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方 提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， DNP充分溶解 存在于液相中； 充分溶解， CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 巯基乙醇是抗氧化剂 CTAB提取缓冲液的改进配方 提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合 （聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物， 物质，有效去除多酚，减少 中酚的污染； 物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 中酚的污染 同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。 有效去除多糖。 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 CTAB法流程图 法流程图植物材料 裂解液酒精沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 SDS法原理 法原理 SDS是一种阴离子去垢剂， 在高温 （ 55～65） 条件下能裂解细 是一种阴离子去垢剂，在高温（ ～ 是一种阴离子去垢剂 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 或 浓度并降低温度（ 提高盐 浓度并降低温度 冰浴） 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 用酚/氯仿抽提 上清液中的 用酚 氯仿抽提， DNA。 。 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 SDS法流程图 以动物组织为例） SDS法流程图 （以动物组织为例）动物组织抽提 离心洗涤 组织匀浆 上层溶液 干燥溶解 细胞裂解 酒精沉淀 DNA溶液 溶液 基因组DNA－ 基因组DNA－其它方法根据细胞裂解方式的不同有： 根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声