PCR教程-的研究生用.ppt

一、DNA置备 6pg/细胞 （一）理想DNA样品的要求 1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2.完整性-DNA大分子。 3.DNA量。 （二）经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。 2.去垢剂（SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。 （三）试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-通过螯合镁离子抑制核酸酶。 2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。 蛋白酶K酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇：除酚，除泡沫。 4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。 （四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。（10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS）。 2.消 化：TNE缓冲液 （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.