DNA序列测定分析.pptVIP

DNA序列测定 第一节 概 述 一、DNA序列测定 三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法） 四、测序的常用方法 （五）用于测序的变性凝胶电泳 胶长40cm，厚度均匀 4~8%丙烯酰胺 7mol/L尿素 四、大片段DNA的测序方法 （一）随机法 超声波处理：将DNA随机断裂成一组相互重叠的300~900bp片段，电泳回收300~600bp片断作亚克隆 DNaseI切割：将DNA随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆 限制酶消化：限制酶将DNA切割为含粘端的DNA片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序 （二）嵌套缺失法 一、化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 三、化学裂解法的特点 不需酶催化 5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA 操作繁琐、费时、分辨率较低 第三节 DNA测序自动化和大规模测序 特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h DNA自动测序与手工测序的不同点 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑 表特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 同上，只在C处断裂DNA链 2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T的破坏被抑制，只有C被破坏释放 C 0.5M哌啶处理，断裂DNA键，C与T有同样速率 15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放 C+T 同上，A断裂比G快 0.2NHCl、0℃、60分钟，碱基被破坏 同上 A 在0.1M碱中，90℃15分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，G断裂比A快5倍 甲基化嘌呤不稳定，在中型PH加热被破坏 稀释250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20℃60分钟，DNAG的N7和A的N3甲基化 强G/弱A DNA断裂 碱基释放 试剂与反应 作用的碱基 在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。 二、碱基特异性修饰及裂解 C 六氢吡啶 胞嘧啶开环 肼（加盐） C C和T 六氢吡啶 嘧啶开环 肼 C+T G和A 六氢吡啶 脱嘌呤作用 甲酸 G+A G 六氢吡啶 鸟嘌呤甲基化 硫酸二甲酯 G 断裂点 主链断裂试剂 碱基修饰反应 碱基修饰试剂 反应体系 （一）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。 （二）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。 （三）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。 （四）使标记片段变性为单链。 （五）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 （六）电泳 （七）放射自显影 （八）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。 二、化学法测序的基本步骤 （三、四略讲） 三、化学法的优点 化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡