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PCR扩增失败的原因分析?? 2010-12-13 16:48:31|??分类：? HYPERLINK /blog/ \l m=0t=1c=fks_083071080084089074080095074071087083080074092085087 \o 默认分类 默认分类|字号?订阅 PCR扩增失败原因分析，PCR产物电泳2010-05-15 16:07 一 模板质量问题： ???? 1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。?? 3） 为什么跑电泳会出现拖带呢？ ?????? 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 ????? 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。 二 引物问题 ??? 1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！ ???? 2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的 三??? Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。 tap酶种类 ??????高特异性Taq酶??? 高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。此外，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。 ?? 此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。 高保真Taq酶?? 下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法 HYPERLINK /Search.asp?ModuleName=ArticleField=TitleKeyword=%BF%CB%C