11-7动物细胞大规模培养.ppt

7.3.4 包埋法: 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。 优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。 缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。 石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法 甲基丙烯酸甲酯包埋标本 微囊型包埋法 7.3.5 微囊法（microencapsulation）: 用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。 7.4 大规模培养技术的操作方式 深层培养可分为: 分批式 流加式 半连续式 连续式 灌注式 7.4.1 分批式培养（batch culture） 较早期的方式，采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养 一次性收获细胞、产物、培养基。 特点: 操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小 直观反映细胞生长代谢的过程。 可直接放大。 细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期五个阶段。 分批培养的周期多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。 7.4.2 流加式培养（feeding culture） 细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。 1）流加培养物的方式 流加的时间通常在指数生长后期，细胞进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次，凡是促细胞生长的物质均可以进行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分既不过剩而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。 2）流加工艺中的营养成分（三大类）： ●葡萄糖：供能物质、碳源物质，浓度较高则产生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。 ●谷氨酰胺：供能物质、氮源物质，需要控制浓度。 大规模培养中细胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因。 ●氨基酸、维生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。 7.4.3 半连续式培养（semi-continuous culture） 1）又称重复分批式培养或换液培养。 采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。 2）半连续式特点： ●培养物的体积逐步增加； ●可进行多次收获； ●细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。  优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 7.4.4 连续式培养（continuous culture） 1）常见的悬浮培养模式：采用机械搅拌式生物反应器系统。在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基（防止衰退期出现）；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。 2）连续式培养的特点： ●细胞维持持续指数增长； ●产物体积不断增长； ●可控制衰退期与下降期。 连续式培养 3）优点： 培养状态恒定，细胞在稳定状态下生长。 稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。 在稳定状态下细胞所处的环境条件可维持不变（如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率）。 细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。 4）不足： ●由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成