新型肝癌靶向性c-myc反义RNA表达载体的构建和对人肝癌细胞的抑制作用.pdf

山东大学硕士论文 新型肝癌靶向性c-myc反义RNA表达载体的构建 及对人肝癌细胞的抑制作用 中文摘要 目的： 构建c-myc反义RNA表达载体和新型肝癌靶向性四元复合物基因定向转移系统， 探讨c—myc反义RNA对人肝癌细胞内靶基因表达、细胞凋亡诱导及细胞周期等生物学 活性的作用；并研究其在荷瘤裸鼠模型体内对肝癌细胞的抑制作用。 方法： 1．c-myc反义RNA表达载体pcDNA3．卜8s—c—myc的构建 粒pcMYC，获得1．356kb的c—myc Extraction a， Kit将两者回收纯化并用T4DNA连接酶进行连接，转化感受态细菌DH5 随机挑选抗性菌落。酶切分析方法筛选出阳性重组克隆。设计c—myc引物(扩增产物 3’；下游：5’’ GcTCTAGAcAGAGTcGcTGcTGGT 3’，用PCR方法鉴定出阳性重组克隆。然后进行DNA测序 和同源性分析。 2．c-myc反义RNA靶向肝癌的体外抑制实验研究 2．1四元复合体基因转移系统的建立 况。利用肿瘤细胞表面特异高表达的表皮生长因子受体EGFR，设计合成针对EGFR的 16肽GE7作为配体寡肽(Ligand 20肽HA20作为内吞小体释放寡肽(Endosomereleasing 成多聚赖氨酸(polylysine，PL)为多聚阳离子多肽(Polycationic 制备EGFR介导的四元复合体基因转移系统。 2．2两种基因导入方法体外基因转染率的比较 HepG2．2．15细胞，3天后用流式细胞仪检测分析绿色荧光蛋白EGFP的表达率。 山东大学硕士论文 2．3c-myc反义RNA瞬时表达对肝癌细胞的体外抑制作用 达、细胞凋亡率并分析细胞周期。同时，以正义表达载体、空载体转染肝癌细胞，并 长抑制作用。 2．4 c，myc反义RNA稳定表达对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用 u 反义RNA转染对数生长期HepG2细胞，24h后，培养基中加入380g／ml的新霉 素，3—4周后筛选出可长期传代并稳定表达c—myc反义RNA的肝癌细胞克隆。绘制稳 胞的抑制作用。同时，以亲本HepG2细胞为对照。 3．四元复合体介导c--myc反义RNA对荷瘤鼠体内肝癌细胞的靶向抑制作用 裸鼠腋窝皮下。注射1×i08个／m1HepG2．2．15细胞悬液0，Iml，制备荷瘤动物模 型。裸鼠腋窝皮下注射肝癌细胞悬液0．iml。10天后，肿瘤直径为0．5cm时，瘤内注 载体注射组为对照。每周注射一次，4周后处死动物，取瘤体，测其直径，观察c—myc 反义RNA对肝癌细胞移植瘤生长的抑制作用。免疫组化方法观察肿瘤组织切片，研究 作用，探讨c-myc反义RNA联合IFN一‘q对肝癌细胞的抑制作用。 结果： 1．成功构建针对原癌基因c--myc的反义RNA表达载体 将1．356kb的c—myc 量扩增抽提质粒，Xbal和HindIII双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳证实目的基因成功插入。 该序列包括编码c—myc蛋白的编码区。 2．四元复合体介导的转染率显著高于脂质体介导的转染率 细胞。流式细胞仪检测EGFP表达，结果显示，四元复合体包被的pEGFP—N1转染率较 2 由衷丈攀颀士论文 LF2000介导的转染率高(44．95％VS33．00】j6)。 3．c-myc反义RNA瞬时表达体外抑制肝癌绷跑的生长 MTT法硷测避示，爱义袭运载镩与对照缱稳逢，霹皴镄亲l耱瘗维藏生长。e—myc 非转染组(24．30％)。细胞凋亡率分析显示：反义RNA缀的凋亡诱导攀为4．49％，麓于 76．04)。纲藏瞒期分车厅显示：爱义RNA转染戆涎餐2缀缒，崮魂GO／G1麓箨洚。 4．c-myc反义RNA稳定表达体外抑制肝瘸细胞的