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WESTERN BLOT 实验技术 定义 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用特定的探针反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 随后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测出低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 基本原理 一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 目的蛋白: RuBisCO大亚基 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）是一种酶(EC 4.1.1.39)，分子量约为550kD，位于叶绿体基质中，是一个双功能酶，它参与了植物光合作用和光呼吸过程，在调节两者之间的关系中起重要作用。Rubisco由8个大亚基和8个小亚基组成，大亚基的分子量为53KD左右，小亚基的分子量为14.8KD左右。 Rubisco也是植物蛋白中含量最丰富的蛋白，约占叶总蛋白的12-35％，叶片可溶性蛋白的50％，是植物体内重要的储藏蛋白。 蛋白样品的制备 方法：0.5 g小麦幼苗叶片 + 5 ml PBS pH 7.8，冰浴研磨成匀浆，4℃ 10000 g离心15 min，离心后，将上清液转至干净离心管中； 取上清液0.8 ml + 0.2 ml 5×Loading Buffer于1.5 ml离心管中，沸水浴5 min。 5×Loading Buffer中含有SDS（去污剂）和β-巯基乙醇（还原剂）；加入样品中后可使得蛋白质解离成单个多肽亚基，并尽可能减少相互间的聚集。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：十二烷基硫酸钠（SDS），是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 （详细见教材49页） SDS电泳-制胶（方法同第五个实验） 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 转膜 半干法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润的滤纸之间，电转1h左右（恒流0.8mA/cm2）。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转4h或过夜。 转膜 本实验选取半干法（使用半干转印仪）。 转膜 从正极到负极依次为：3层滤纸：NC膜：凝胶：3层滤纸； 转膜注意点： 将所用的NC膜，用铅笔在边角处做个标记，以与其他小组的相区分； 转移buffer现配现用 全班共配1000 ml（配法见教材43页），每组用培养皿分装 膜和滤纸在转移缓冲液中浸泡5 min; 下三层滤纸＞NC膜＞凝胶切块=上三层滤纸 赶气泡。 为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理（将膜在高浓度的蛋白质溶液中温育）。 封闭液：脱脂奶粉（3％） 或BSA或Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 本实验选用3%脱脂奶粉（溶于TBST缓冲液中），4℃封闭过夜。