双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分解.pptVIP

双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析 教 师：程 琳 2011 年 11 月 实 验 目 的 1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法； 2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。 2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。 二、序列比对分析 1. 相似性与同源性 相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。 2. Blast简介及应用 （1）Blast简介 BLAST 是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。 BLAST是“局部相似性基本查询工 具”（Basic Local Alignment Search Tool）的缩写。 1、NCBI主站点： /BLAST/（网络版） /blast/ （单机版） 2、其他站点： /blast/ http://nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/（果蝇） … 思 考 题 1. 序列的同源性和相似性有什么区别？ 2. 在网上查询一个序列信息的步骤有哪些？ 提交任务 返回查询号（requestid） 可以修改显示结果格式 修改完显示格式后点击进入结果界面 结果页面1 图形示意结果 结果页面2 目标序列描述部分 带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列 匹配情况，分值，e值 结果页面3 详细的比对上的序列的排列情况 （4）一个例子 假设以下为一未知蛋白序列 query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我们通过blast搜索来获取一些这个序列的信息。 具体步骤： 1.登陆blast主页 /BLAST/ 2.根据数据类型，选择合适的程序 3.填写表单信息 4.提交任务 5.查看和分析结果 1.登陆ncbi的blast主页 2.选择程序，因为查询序列是蛋白序列可以选择blastp，点击进入 也可以选择tblastn 作为演示， 我们这里选blastp 3.填入序列（copy＋paste） Fasta格式，或者纯序列 4.选择搜索区域，这里我们要搜索整个序列，不填 5.选择搜索数据库，这里我们选nr(非冗余的蛋白序列库)。 是否搜索保守区域数据库（cdd），蛋白序列搜索才有。 我们选上 6.限制条件，我们限制在病毒里面找。 7.其他选项保持默认值 打分矩阵 * 分子生物学实验 DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。 A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。 B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。 一、DNA测序的方法 1. Sanger双脱氧链终止法测序原理 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是