酵母双杂交课题.ppt

南京农业大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系 南京农业大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系 * * * * * * * * * * 2015年12月18日 酵母双杂交系统（The yeast two-hybrid system ） 李小林 DNA 甲基化 酵母双杂交属于研究蛋白质相互作用的常用方法，还包括免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）和GST pull-down技术 酵母双杂交的建立 Fields等在1989年提出的，是基于对真核细胞转录因子（酵母转录因子GAL4性质）的研究。 GAL4包括两个彼此分离但功能必需的结构域 ：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 单独的DNA结合域或转录激活域均不能激活下游基因的转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 酵母双杂交模型 Fields建立的双杂交系统，即BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用， 将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171 菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用. 如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 双杂交系统 DNA 甲基化 1 酵母双杂交系统中两个“Hybrid”的构建 DNA 甲基化 1 X与Y蛋白的相互作用，将BD与AD拉近到一定的空间距离 　　1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 　　2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 　　3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 　　4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。 酵母双杂交的大致步骤 DNA 甲基化 1 DNA 甲基化 1 　　1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。 　　2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。 　　3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。 　　4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统检测的高度敏感性 南京农业大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系 南京农业大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系 * * * * * * * * * *