第二章基因工程制药1概述.ppt

基因工程制药 生物技术来源药物的发现和筛选 目的基因的获得 基因表达 基因工程菌生长代谢特点 基因工程菌的不稳定性、 基因工程菌中试基因工程菌的培养 高密度发酵 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的质量控制 基因工程药物的制造实例 第一节 生物技术来源药物的发现和筛选 生物技术来源药物的发现和筛选 目前用于发现和筛选生物技术新药的技术和手段有以下几种。 （1）从自然界、人或动物或植物中分离提取具有药物作用的生物活性蛋白，以基因工程技术钓取或合成其对应的基因片段，构建能表达制造某种药物的工程菌或细胞株。 （2）从基因工程构建的基因组DNA文库中，筛选表达某生物功能的活性蛋白的克隆，制备该活性蛋白，通过理化生物活性的分析和进一步筛选来获得生物技术新药。 生物技术来源药物的发现和筛选 （3）应用PCR技术、噬菌体表面展示技术构建噬菌体展示文库、细菌表面表达文库，从这些随机肽库中或融合随机多肽库中，以单克隆抗体或纯化蛋白或受体或完整的细胞作为陪体，筛选出与之结合的多肽和蛋白分子及其相对应的DNA片段，从中进一步筛选开发成新的生物技术新药。 生物技术来源药物的发现和筛选 （4）应用蛋白质工程技术和计算机模建技术，对活性蛋白进行突变、剪切、修饰改造或设计全新的分子，应用基因工程技术生产被改造的或新的分子，筛选出有效的新的活性多肽和蛋白质药物。 （5）应用DNA合成技术，合成阻断有害基因的复制、表达的寡核苷酸（反义核酸、核酶和抗基因寡核苷酸）药物，此外通过合成技术合成随机寡核苷酸库，通过与蛋白多肽或有机分子等配体的结合与作用来筛选寡核苷酸药物。 生物技术来源药物的发现和筛选 （6）应用基因工程技术为基础的酵母双杂交系统，通过在其体内检测蛋白质与蛋白质的相互作用，寻找与某已知蛋白质相互作用的未知蛋白质，直接克隆未知蛋白的基因，筛选某些修饰的调整蛋白，通过药理作用的验证，发现和设计新的生物技术药物。 （7）人类基因组计划的实现，新的靶基因或靶蛋白将成为开发生物技术新药的源泉。约30亿对核苷酸、3~4万个基因序列的确定，以生物信息学分析、分离功能基因和致病基因，通过基因表达、蛋白质分析、功能与代谢、药效毒理和药理学的研究，发现和设计新的生物技术药物 生物技术来源药物的发现和筛选 （8）通过基因工程技术，对一些小分子药物如抗生素等的生物合成途径中的多酶体系基因簇进行缺失、替换等突变，重建整个合成途径，最终产生与组合化学文库相似的组合生物合成文库，从中筛选具有新特性的小分子药物。 第二节 目的基因的获得 基因克隆的方法策略选择原则 反转录法 RT-PCR法 化学合成法 新方法 一、基因克隆的方法策略选择原则 类型I ：已知基因的序列 类型II ：已有基因图位或标记，转座子等条件 类型III ：未知目的基因序列 类型I ：已知基因的序列 （1）已知DNA序列，包括三种情况，一是已知目的基因的DNA全部或部分DNA序列；二是已知其它物种的同类基因的DNA序；三是已知目的基因cDNA全部或部分序 （2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。 类型II 已有基因图位或标记，转座子等条件 分别可采用转座子标签法、T-DNA标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。 类型III ：未知目的基因序列 （1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和DDRT-PCR、SSH-PCR、RAP-PCR、DNA-RDA、cDNA捕捉法等进行克隆。 （2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测序法等进行，是难度较大较繁琐的策略。 总结 从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因。第二种类型是表型克隆。是近年来发展十分迅速的一类方法，例如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等。第三类是无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。 二、反转录法 从真核细胞中分离纯化mRNA，以其为模板反转录合成该蛋白质mRNA互补DNA，再以cDNA在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，使mRNA合成互补的DNA，最终合成编码该多肽链的双链DNA序列。 １、mRNA的分离 材料来源 表达最丰富的组织细胞 mRNA的分离 寡聚脱氧核苷酸的亲和层析 ２、第一股cDNA的合成 ① mRNA为模板 ② Oligo(dT)12~18脱氧胸腺嘧啶核苷酸位引物 4种碱基随