大肠埃希氏菌剖析.ppt

GB 4789.38－2012食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 参考标准 本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual（2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。 VRBA－MUG平板计数法 MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。经实验发现，在MUG浓度从0 ?g/mL到200 ?g/mL的范围内，大肠埃希氏菌生长繁殖率没有区别。 MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍受关心的O157:H7菌株为阴性，令人感到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这样的问题。 VRBA－MUG平板计数法 常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能耐受44℃的培养温度而同样不能检出O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧光的能力没有抑制作用。 VRBA－MUG平板计数法 研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。 VRBA－MUG平板计数法 本标准采用的VRBA-MUG平板计数方法，正是以上述理论为依据，参照FDA方法而确立的，检验时间为18 h～24 h，并能准确测出样品中大肠埃希氏菌的CFU数值，操作简便，但对于对染菌量低（如＜10 CFU/g）的样品不如MPN法适用。 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产品。 2 术语和定义 2.1 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋――或－＋――的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 卫生学意义 大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠埃希氏菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：44.5℃±0.2 ℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3 设备和材料 3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11 菌落计数器。 3.12 紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6 W。 4 培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。 4.2 EC肉汤（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用] 。 4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基。 4.6 磷酸盐缓冲液。 4 培养基和试剂 4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂。 4.8 营养琼脂斜面。 4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。 4.10 VRBA-MUG。 4.11 革兰氏染色液。 4.12 Kovacs 靛基质试剂。 4.13 无菌1 mol/L NaOH。 4.14 无菌1 mol/L HCl。 大肠埃希氏菌计数 大肠埃希氏菌MPN计数（第一法） 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法） 大肠埃希氏菌计数：第一法 大肠埃希氏菌计数：第一法 5.2 操作步骤 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 r/min～10 000 r/min均质1min～2 min，制成1:10 样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调节。 5.2.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样