第5章荧光光谱精讲.ppt

第5章 荧光光谱 5.1 基本原理 5.2 荧光探测 5.3 荧光光谱法的应用 课堂练习 * * 5.1 基本原理 5.2 荧光探测 5.3 荧光光谱法的应用 荧光属于光致发光 包括吸收和发射两个过程 荧光光谱属于发射光谱 光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等 我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化合物分析 5.1.1 荧光发光原理 光致发光的能级向下跃迁过程 无辐射跃迁：激发态→第一电子激发态的最低能级 在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子激发态的最低能级 荧光发射：第一电子激发态的最低能级→基态能级 由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释放能量，即荧光 磷光发射：三重态→基态能级 先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级，发射磷光 荧光与磷光的区别 从激发态跃迁到基态的路径不同 从激发到发光的时间不同，荧光10-9~10-7s 磷光10-3~10s (三重态是亚稳态) 发光波长不同，荧光波长比磷光波长短 5.1.2 荧光光谱与吸收光谱 形状 波长 谱带数 荧光光谱与吸收光谱的比较 荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9） 荧光光谱选择性好，能吸收光的物质不一定能发射荧光，一定波长下不同物质的荧光光谱不同 荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光，并且荧光对环境因素非常敏感 5.1.3 产生荧光的基本条件 入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态振动能级 物质粒子要具有高的荧光效率 荧光过程速率常数，由物质粒子本身决定 物质分子结构与荧光效率 具有大共轭双键的分子容易发射荧光，π→π*跃迁的量子效率高，寿命短（10-9~10-7 s） 共轭效应越大，荧光效率越高，苯 萘 蒽 苯 萘 蒽 物质分子结构与荧光效率（Cont.） 刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而减小与其它分子碰撞的可能，芴 ≈1.0 联苯 0.18 芴 联苯 取代基也会影响荧光效率 给电子基(-NH2, OH)会增强荧光效率（共轭作用） 吸电子基(-NO2, -C=O, -C=NH)会减弱甚至猝灭荧光 取代基的空间阻碍作用会减弱荧光 5.1.4 影响荧光光谱的因素（外部） 入射光强，荧光强度与入射光强成正比 溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用 增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加 温度，升高温度 → 物质粒子碰撞增多 → 减弱荧光 pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大 内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光 自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收 吸收光谱与荧光强度（激发的选择？） 波长 强度 吸收光谱 波长 强度 荧光光谱 吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃迁产生的荧光越强 5.2.1 荧光探测装置 吸收光谱 荧光光谱 两点区别： 在入射光的垂直方向探测 探测器前还有一个单色器 F-4500荧光光度计光路图（日立） 5.2.2 荧光团 许多物质不会发射荧光或荧光效率低 需要利用强荧光发射的荧光团（或荧光探针分子） 荧光探针分子需满足两个条件： (1) 能与待测物质某个微区专一而牢固的结合 (2) 这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象 一些典型的荧光团 色氨酸 348 nm 4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚 461 nm 增强型绿色荧光蛋白 509 nm 四甲基罗丹明 576 nm 染料 667 nm 染料cy3的吸收、发射光谱 最大激发波长 550 nm 最大发射波长 570 nm (黄绿光) 绿色荧光蛋白（GFP） GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用的活体报告蛋白 5.2.3 荧光探测方法 同步荧光光谱技术 (1) 在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图 (2) 两种同步扫描形式——固定波长和固定能量 (3) 固定波长：激发波长与发射波长间隔固定 (4) 固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定 (5) 特点：① 与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善