Western_Blot实验详解(2010-07-07).docVIP

Western Blot实验详解 实验材料 Western Blot相关试剂： 2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0.5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。25ml 4×Upper buffer; 4.25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。 10×电泳缓冲液（pH 8.3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30.2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS，定容至1L。（注：SDS在68℃水浴中溶解）。工作液：1×电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。 1.5M Tris-HCl(pH8.8)：Tris 181。7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8.8，定容至1L 室温保存。 1M Tris-HCl(pH6.8)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。 10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g， 1M Tris-HCl(pH7.5) 100ml，去离子水定容至1L。工作液：1×TS 室温保存。 1M Tris-HCl(pH7.5)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。 10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。用10%HCl调pH至7.2，定容至100ml。 1×Transfer Buffer： 在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3.03g Trisgrams，14.43g甘氨酸，最后加入200ml甲醇。4℃保存。 30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29.0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。4℃避光保存。 10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。分装，-20℃保存。 Western Blot相关仪器： 电泳仪；转移仪；摇转仪。 实验原理 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作程序与结果判定 操作程序： （一）蛋白样制备 无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM（10%血清），再过22h后处理细胞。 吸出培养液，用PBS洗1-2次。 每个皿（60mm）加入200-300ul细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。(最好处理完一个样品后再处理另外的样品，不要同时处理) 4。 用一次性1ml针筒吸出裂解的细胞液，注入1.5ml离心管中，用针筒吸打至清亮。 5。 取80ul 2×Sample Buffer混匀，37度30min，沸水10min，1200rpm 10min 取上清，冰浴，上样，剩余样品-20度储存。 （二）SDS 制备分离胶5ml加入组装好的玻璃板中，立即水封。（一般配10%分离胶） 待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶3ml插入梳子，待凝固。 胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。 用针筒吹净每个孔。 上样，通电电泳：浓缩胶电压90V（约30min）分离胶120V（约90min）。 （三）转膜（湿转）(100KD以上)，小的蛋白片段建议半干转膜。 海绵，滤纸在转膜液中浸泡，PVDF膜在甲醇中浸泡2min。 在玻璃板上铺海绵，五层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。将其整体转移到转膜夹上。 12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。 注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF膜-五层滤纸-海绵-阳极 （四）封膜 配制封膜液，在20ml 1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保鲜盒中。 将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。 摇床上摇2h。 （五）一抗 把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇4h。 （六）二抗 将一抗回收，放入-20度冰箱中。 在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。 倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8ml），摇床2h。 （六）洗膜，显影，定影 将二抗回收，放入-20度冰箱中。在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。 将A、B液按1：1配制，在