PRRS实验室诊断监测分解.pptVIP

PRRS实验室诊断监测技术  -----RT-PCR检测技术 ;主 要 内 容;动物病毒的组成;PRRS病毒粒子的结构;PCR 技术;概念;PCR技术简史;PCR技术简史;PCR技术简史;基本原理;;PCR反应条件;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 ;（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。;2）循环参数 变性 一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 (2) 退火 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ;3）延伸 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用 温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 ;PCR的特点;PCR的应用;PRRSV RT-PCR 检测技术;用途;原理;反转录;自备的器材;样品的制备;2.1 组织样品处理：称取猪组织0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心2 min，取上清液100 μL 于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.2 全血样品处理：待血凝后取血清100 μL，置1.5 mL 灭菌离心管中。 2.3 阳性对照处理：取阳性对照100 μL，置1.5 mL 灭菌离心管中。 2.4 阴性对照处理：取阴性对照100 μL，置1.5 mL 灭菌离心管中。;操作步骤;2 RT-PCR 操作程序 每份总体积 20 μL，含16.8 μL RT-PCR 反应液（用前混匀），1.2 μL 酶混合液，2 μL 模板RNA。 例如：n 份样品（n10），配制n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反应液，再加入1.2×（n+1）酶 混合液混匀，取18 μL 分装成n 份，分别加入2 μL 模板RNA，加入矿物油20 μL 覆盖（有热盖的PCR 扩增仪不用加矿物油），作好标记。 在 PCR 扩增仪上进行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min；扩增条件为94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃延伸7 min。;3.电泳;结果判定;注意事项