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多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法
一.实验原理:
样品(蝇蛆多肽提取物)将铁氰化钾(K3Fe(CN)6)还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6),亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝(亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3),在700nm测吸光度值,通过测定吸光度来判断受试物还原力的强弱。
铁氰化钾溶液为黄色,猜测用三氯乙酸(CCL3COOH)与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀,离心除去,排除对吸光度数值的影响。
;二.查阅文献以确定多肽浓度
1.多肽浓度与吸光度完全成直线关系的;②;③;④;2.多肽浓度与吸光度关系不是成直线的(有一点弧度的);②;③;3.自认为有点靠谱的;综上所述,自认为多肽浓度暂时设置成0、1、2、4、8、20、40mg/ml
但pH 值对多肽总还原力的影响,酶与底物比对多肽总还原力的影响,温度对多肽总还原力的影响。以及参考文献中多肽结构含量等与蝇蛆多肽不一致等因素的影响,此浓度设置肯定存在不足。;三.试剂的配置;注意:
配置不同浓度的样品溶液梯度,依次加入一定量磷酸缓冲液(保证溶液反应的PH环境,如2.5ml pH=6.6)、一定量浓度的铁氰化钾溶液(2.5ml 1%),混合均匀,将该体系置于一定温度下(比如:50℃,不能过高,不然会使物质失活,适当加热可以保证反应程度和时间)恒温水浴放置一定时间(如20min,以反应充分为宜),取出加入三氯乙酸溶液混匀,置于离心机内3000转离心10min(离心机使用时一定保证对侧样品等重),取一定量上清液于另一试管中,加入蒸馏水和三氯化铁溶液(3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ,黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中,产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀,即普鲁士蓝,测定吸光度时要摇匀,且普鲁士蓝耐热性在140℃,光照下较稳定,不用避光),混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。
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