2016细胞培养准备灭菌资料.pptVIP

第三章细胞培养的准备工作; 玻璃器皿 金属器械 橡胶 塑料制品 ;玻璃器皿的清洗 浸泡（自来水）→ 烘干 →酸泡（24小时） →自来水冲洗→蒸溜水浸泡过夜和冲洗8到10遍→ 50℃烘干 橡胶、塑料制品的清洗 清水清洗→浸于自来水过夜→用纱布或棉签和50℃稀洗液刷洗→流水冲洗（15－20遍） →晾干→浸于清洁液15分钟→流水冲洗（15－20遍） →蒸馏水浸洗三次，三蒸水泡24小时→晾干或50℃烘干备用。;金属器械的清洗 放到含洗涤剂的水中反复刷洗后→自来水反复冲洗干净→晾干→用75％酒精擦拭→自来水反复冲洗干净→最后三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干备用。 正压除菌滤器的清洗 含稀洗涤剂的水中，反复刷洗后→流水冲洗15min →漓水→蒸馏水浸泡24h →三蒸水浸泡24h →晾干或50℃烘干备用。;塑料器材 常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸头。 ;;配制时先在容器中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾， 再将容器置流动自来水中，待重铬酸钾液冷却后， 缓慢加入浓硫酸，边加边搅拌。;包装材料：报纸（枪头盒、瓶口不能拧紧，用报纸包好，灭完菌 烘干之后，拧紧） 硫酸纸 铝箔 纱布（包15毫升离心管） 金属消毒桶 铝质饭盒 方式：全包装 局部包装;;消毒灭菌方法;物理法1：紫外线消毒;;;物理法2：干热消毒;物理法3：滤过消毒;;用于滤过除菌的各式滤器;物理法4： 湿热灭菌;高压蒸汽灭菌器;化学消毒灭菌法;化学消毒剂的使用原则;化学消毒剂的分类;化学消毒剂的使用方法;常用消毒剂;过氧乙酸;;福尔马林(37 -40%的甲醛溶液);;戊二醛;;含氯消毒剂;;乙醇;苯扎漠铵(新洁尔灭);;;总结：物理消毒;总结：化学消毒;无菌室的灭菌： ;实验人员的无菌准备：;无菌操作的注意事项：;培养前准备;操作间消毒;;专门人配液，灭菌，标签 一切用品固定存放； “避免污染”;第二节、细胞培养用液;水： 平衡盐溶液（PBS） ： 消化液： 培养基 抗生素液： 染色液：;（一）水;（二）平衡盐溶液;;;（三）消化液;胰蛋白酶消化液;EDTA－２Na;胶原酶溶液;细胞培养用容器及培养基 Culture vessels and medium for animal cell culture;培养基（液）是维持体外细胞生存和生长的溶液 天然培养基： 合成培养基：氨基酸、维生素、糖类 无机离子、其它成分 完全培养基：合成培养基+血清 无血清培养基： ;（一）天然培养基; 血清(serum)： 一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。 灭活：56度，30min消除补体活性。 成分：总蛋白3.5-4.5g/100ml 球蛋白不高于2g/100ml 外观：透明淡黄色，无溶血，无沉淀。 ;;①多种PR（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分;血清的使用与储存;影响血清的各种因素;细胞培养中使用血清的缺点;关于血清的几个问题; 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。;血浆：1907年Harrison首次使用 优点：支持培养组织块，供给细胞生长物质。 缺点：易于液化。 ;;（二）合成培养基;常用合成培养基;;;干粉培养基;完全培养基;完全培养基配制举例: 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青霉素 50~100IU/ml培养液 链霉素 50~100ug/ml培养液 ;配制: RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100IU/ml 加三蒸水至1000ml, 过滤除菌,调节pH值至7.2 ,加血清（终浓度10％）.;（三）无血清培养基; 血清中不仅存在促细