MiR200a对人胰腺癌干细胞上皮—间质转化EMT和体外生物学行为影响的实验研究.pdfVIP

MiR-200a对人胰腺癌干细胞上皮-间质转化（EMT）及体外生物学行为影响的实验研究 中文摘要 MiR-200a对人胰腺癌干细胞上皮-间质转化（EMT）及体 外生物学行为影响的实验研究 中文摘要 目的 研究miR-200a对从人胰腺癌细胞系PANC-1分选出的胰腺癌干细胞（Pancreatic cancer stem cells，PCSCs）EMT及体外生物学行为的影响。探索靶向调控胰腺癌干细 胞中miR-200a的表达在预防及治疗胰腺癌方面的可行性。 方法 (1) 细胞培养和流式细胞仪分选 将人胰腺癌细胞系PANC-1细胞接种于由含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基、 青霉素(10U/ml)和链霉素(100μg/ml)组成的培养基中，在5％CO2，饱和湿度，恒温37°C 培养箱中培养。分散后的细胞进行计数，移至5ml的试管中，用PBS洗涤两次，以1× 106/100μl 重新悬浮于PBS 中。分别加入抗人CD24-PE 、抗人CD44-APC 和抗人 ESA-FITC抗体（稀释度均为1:40），避光冰上孵育20 min。根据厂商说明书将各自同 型对照抗体配成相同浓度使用。PBS洗涤2次，样本用500μl PBS重悬，进行流式细胞 仪分选。细胞常规分选两次，并重新分析的纯度，保证分选后的细胞纯度 97％。数 据用BD FACS Diva的软件进行分析。 (2) 转染miR-200模拟物 将CD24+CD44+ESA+胰腺癌干细胞接种在6孔板中并孵育过夜。将含miR-200模拟 物或者阴性对照序列的EntransterTM-R转染液（配制成终浓度25nM）转染细胞。转染6 小时后更换培养液以避免细胞死亡。 (3) 实时定量RT-PCR 根据说明书用Trizol法提取总RNA，使用Power SYBR_ green PCR master mix试剂盒进行实时定量RT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin、vimentin、ZEB1、 I 中文摘要 MiR-200a对人胰腺癌干细胞上皮-间质转化（EMT）及体外生物学行为影响的实验研究 Oct4和Nanog的mRNA表达。以GAPDH为内参照。 (4) microRNA表达分析 使用miScript Reverse Transcription Kit逆转录细胞总RNA。使用miScript PCR Kit 进行RT-qPCR分析转染组与非转染组、阴性对照组胰腺癌干细胞miR-200a表达水平。 以U6为内参照。 (5) Western blot检测 用RIPA裂解缓冲液裂解细胞并测定蛋白质浓度。SDS分离总蛋白并转移到 聚偏氟乙烯膜。配制含5%脱脂奶粉、0.1% Tween 20的TBST缓冲溶液封闭膜，加一抗 （兔抗人Oct4, l:2000；兔抗人Nanog, 1:2000；兔抗人N-cadherin, 1:1000；鼠抗人 Vimentin, 1:500；兔抗人E-cadherin, 1:1000；兔抗人ZEB1, 1:1000）室温孵育2小时。 再加入HRP-偶联的二抗（HRP-羊抗兔IgG抗体，1:5000；HRP-羊抗小鼠IgG抗体， 1:5000）室温孵育1小时，增强化学发光检测系统检测结果。提取未转染和已转染 miR-200a模拟物的细胞总蛋白进行Western blot，检测E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、 vimentin、Oct4和Nanog蛋白表达水平。以β-actin为内参照。 (6) Transwell小室迁移实验 1×105 PCSCs被平铺于非涂覆膜的上室，使其可以朝向下室中含血清的培养基迁 移。孵育48小时后多聚甲醛固定细胞，以0.1％结晶紫（2 mg/ml）染色。在光学显微 镜下计数通过膜孔迁移的细胞数量。每孔观察3个随机视野。 (7) Transwell小室侵袭实验