二维凝胶电泳和质谱技术.ppt

双向凝胶电泳和质谱技术;主要内容;导 课;蛋白质组研究策略;;;目前唯一能分离上千种蛋白的技术;;Extraction of protein;1.1.1电泳的基本知识; 蛋白质电泳的原理一： 蛋白质是两性电解质：在不同的pH条件下，所带电荷不同。 当蛋白质各种带电离子所带正电荷数与负电荷数相等时,此时溶液的pH就是这种蛋白质的等电点(pI). 不同蛋白质等电点不同，在同一缓冲液中所带电性及电量不同，电泳时迁移的方向和速率不同。 ;1.2.1 等电聚焦定义;+; 1.2.2固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG） ;1.3.1 二维SDS;1.3.2 SDS的基本原理;SDS： 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 作用: 断裂分子内和分子间的氢键 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 ;胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。;SDS;2. 二维电泳基本操作流程;裂解液: 8M 尿素 4% CHAPS 50mM DTT 2% IPG buffer 40mM Tris base;2.2 IPG 胶条的水化和上样;2.2 IPG 胶条的水化和上样;2.3 第一向: 等电聚焦;2.4 第二向: SDS SDS 平衡 SDS;2.5 常用检测蛋白的方法;2.6 凝胶的图像处理分析和典型流程;2.7 蛋白点获取;2.8 蛋白鉴定;3. 二维电泳存在问题;4. 二维电泳研究进展;;;Ettan DIGE system-2;;如何鉴定二维电泳分离出来的蛋白点？;质谱与蛋白质;什么是质谱？;质谱的定义;质谱鉴定蛋白的一般方法; 数据及供电系统 ┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓ 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 ┗━━━━━╋━━━━━━┛ 真空系统 ;离子源;常见的电离方式;为什么不能使用硬电离方式分析蛋白分子？;诺贝尔奖的提示;对离子源的贡献—软电离方式;软电离方式;电喷雾电离质谱术ESI （ Electrospray ionisation ）;Rayleigh Limit Reached;阳离子或阴离子模式?;溶液pH值的高低，控制了样品的官能基（functional group）离子化的狀況。 pH值高于5，C-terminal的部份才会离子化，pH值低于7的時候，N-terminal的氢才会游离，lysine和arginine的N端通常要低于pH3.5才会离子化，这表示在酸性溶液中（如pH3.5或更低）会使蛋白质帶正電，在碱性环境中則让蛋白质帶負電，ESI一般都在酸性环境下分析帶正電的peptide ion。 ;电喷雾电离;电喷雾电离的基本过程;电喷雾电离产生多电荷离子：;多电荷离子的有关计算;肌红蛋白电喷雾质谱图 带10~30个电荷的系列分子离子;影响ESI因素：;ESI小结：;基质辅助激光解吸电离技术MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization) ;基质辅助激光解吸电离(MALDI);关于基质： 极性化合物 溶解样品 芳环 吸收激光 易结晶 均匀分散样品分子 MALDI常用基质; 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶); 能溶解于可溶解样品分子的溶剂; 在真空状态下是稳定的; 可吸收激光,既与激光形成共振吸收; 可激发样品分子离子化。 ;样品引入方式：a). 直接进样 优点： a). 快速获得分子量的信息; b). 快速获得混合肽的肽谱. 缺点: a). 金属离子干扰, Na, K； b). 离子源结构复杂,； c). 没有LC/MALDI 接口； d). 实现MS/MS 困难 e). 需要基质 质量范围: 分子量小于500,000 Da;MALDI AND ESI;质量分析器 Mass analysis;两组四极杆