第四章-1 基因工程.ppt

第四章 基因工程原理——基因工程的基本工具Gene Engineering;定 义;基因工程基础——核酸;基因工程药物的生产过程;第一节 基因工程菌的构建与培养;一、工程菌简介;蛋白名称 用途;蛋白名称 用途;蛋白名称 用 途;2、生产限制性内切酶;3、生产生物小分子;4、生产生物多聚体;基因工程在生物工艺中的应用;大规模生产生物活性物质;基因工程的基本形式;3 基因工程的基本条件;基因工程的主要操作步骤 ;A 用于核酸操作的工具酶;限制性核酸内切酶;限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶;限制性核酸内切酶;Ⅰ型酶： ?来源：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 ?限制修饰: 同时具有内切酶和甲基化酶的活性， ?蛋白结构:分子量较大,是一个三亚基双功能酶。 ?辅酶：Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、 ?识别位点：15bp，非常特异 5’-TG?NNNNNNNNTGCT-3’ 3’-ACTNNNNNNNN?CGA-5’ N: 任一碱基；?：6-甲氨基嘌呤 ?酶切位点：识别位点上游约1000bp处. 但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。;限制性核酸内切酶;4. 识别顺序; ②识别序列一般是回文序列 Eco RI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ③简并识别序列 ?有些酶的识别序列不是一个，而是多个。 ?在基因重组时要尽量少用这些酶 ;2、特点;5、酶切位点;EcoRI等产生的5‘粘性末端;PstI等产生的3‘粘性末端;PvuII等产生的平头末端;;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽链。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。 另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。 ;DNA连接酶;DNA连接酶;DNA连接酶;DNA连接酶;DNA连接酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶;大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;DNA聚合酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶;应用：;DNA聚合酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶;DNA聚合酶(DNA polymerase);核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸酶;核酸修饰酶;TdT的基本特性：;核酸修饰酶;核酸修饰酶;;基因工程中常用的工具酶;DNaseI;;TaqDNA聚合酶;RNA聚合酶;其它酶类;p60;B 用于基因克隆的载体;载体的功能及特征;载体的基本特征及特征;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;pBR322;质粒;质???;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;l 噬菌体生物学特性： 生物结构;噬菌体或病毒DNA;;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体载体-λ类噬菌体载体 ;噬菌体或病毒DNA;（i）插入型载体 ;噬菌体或病毒DNA;（ii）替换型载体;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒