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第四章 基因工程载体 ;第一节 概述;按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体等。 按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。;载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 ;第二节　克隆载体;克隆载体具备的条件;⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 ⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 ⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 ⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。;一、质粒载体;;2.质粒的生物学特性;(3)质粒的拷贝数:是指每个宿主细胞内质粒的数量。根据每个宿主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少，为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多，可达10-200个拷贝)。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 (4)质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)：两种不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。(亲缘关系密切的,野生型和其衍生质粒。);3.质粒载体的发展概况;4.标记基因;;4.2 筛选标记基因;; (2)插入失活(insertional inactivation) 在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。 ;抗药性标记选择(插入失活法) ;5 常用质粒克隆载体;5.1 pSC101质粒载体 一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr ）。有HindⅢ 、EcoRⅠ、BamH Ⅰ 、SalⅠ 、Xho Ⅰ 、PvuⅡ、Sma Ⅰ 7种核酸内切限制酶。其中在HindⅢ 、 BamH Ⅰ、 SalⅠ 3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。 是第一个真核生物的克隆载体。;; pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 ;“pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则： “P”表示是一种质粒； “BR”表示最初构建它的实验室(BR代表了两个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez) “322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来(另外还有pBR325，pBR327，pBR328;;pBR322的结构来源;pBR322质粒载体的优点： (1)、具有较小的分子量； 它的分子量为4363bp。意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链，重组的pBR322的大小仍在可操作的范围内(＜10kb)。 (2)、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，;;;; (3)、具有较高的拷贝数。 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子；而且经过蛋白质合成抑制剂（氯霉素扩增）之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR 322质粒分子。;5.3 pUC质粒系列;;;pUC质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝。 适用于组织化学方法检测重组体,有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的?-肽链可参与?-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有MCS区段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。;5.4 T-载体;;6 质粒克隆载体的用途 ;二、 λ噬菌体载体; 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。;λ噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来