β-半乳糖苷酶活性分析.docVIP

β-半乳糖苷酶活性检测 nifH-lacZ表达的β-半乳糖苷酶活性测定： （1） 液体活化待测菌株，将待测菌株接种于5ml含适当抗生素的液体L3基本培养基中，37℃摇床，250rpm振荡，过夜培养； （2） 收集菌体，并用无氮的L3基本培养基洗2次； （3） 将菌液用不含氮的L3培养基稀释至OD600=0.2~0.4； （4） 将4ml菌液注射至事先配气的血清瓶中（空气+氩气，调整合适的氧气浓度，微好氧3%），37℃，200rpm诱导3.5~4hr（每个样品3个重复）； （5） 取出2ml样品于离心管中，100μl用于测定β-半乳糖苷酶活性，其余用于测定OD600； （6） 100μl样品加到2ml离心管中，加入900μl Z-Buffer混匀，加入20μl 0.1%SDS，40 μl氯仿，振荡20~30sec，同时设两个空白对照，加入100μl不含菌体的培养基作为样品，其余与测试样品的处理完全一致； （7） 样品和ONPG (4mg/ml)置于28℃水浴平衡5~10min，依顺序加入200μl ONPG并准确计时，直至样品???黄，加500μl 1M Na2CO3溶液终止反应，准确记录反应时间； （8） 离心12000rpm，15min，取上清测定OD420和OD550。按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性： （T：反应时间， V：反应中菌体体积） β-半乳糖苷酶活性分析试剂: （1）Z-buffer：16.1g/L Na2HPO4·7H2O；5.5g/L NaH2PO4·H2O；0.75g/L KCl；0.246g/L MgSO4·7H2O；调pH至7.0，121℃灭菌30min，室温可保存一年。 （2）Z-buffer/β-ME ：100ml Z-buffer中加入0.27ml β-巯基乙醇。 （3）ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷): 提前两小时将ONPG溶于Z-buffer/β-ME中，浓度为4mg/ml，-20°C保存。