活性测定444.pptVIP

实验八 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定 ——改良赖氏法 【实验目的】 掌握改良赖氏法测定ALT的原理、注意事项和临床意义，熟悉标准曲线的绘制。 【实验原理】 1、催化反应 ALT催化谷氨酸与丙酮酸间的氨基移换反应： 2、显色反应 注意：α-酮戊二酸也与2，4-二硝基苯肼反应产生苯腙，但两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500~520nm差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。据此特点，可计算出丙酮酸的生成量。 【操作步骤】 （一）样品准备： 样品为空腹血清、血浆（肝素抗凝，0.1mg肝素可抗凝1.0ml血液；EDTA抗凝，1.8mgEDTA可抗凝1.0ml血液）。样品应在低温条件下运输保存，样品中ALT在2～8℃可稳定7天。 （二）标准曲线绘制： （三）血清酶活性测定 取2支试管，按下表操作 【实验结果】 （一）绘制标准曲线图 以ΔA为纵坐标，以相当于酶活力（KarU）为横坐标，利用标准曲线绘制的数值在坐标纸上制作标准曲线。 先描散点图，然后用光滑的细线连接各点。 （二）待测血清结果读取 1、求ΔAU值：ΔAU=AU-AB 2、结果读取： 在标准曲线上找到相应的点，读取横坐标的数值，即为待测血清ALT酶活性。 【参考值】 0~25 KarU或0～40U／L（37℃） 【临床意义】 1．ALT活性在下列疾病可见增高： （1）肝胆疾病：传染性肝炎、肝癌、肝硬变活动期、中毒性肝炎、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎等。 （2）心血管疾病：心肌梗塞、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等。 （3）骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良等。 2．一些药物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、异菸肼、奎宁、水扬酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等。 【方法学评价】 本法重复性、准确性、试剂稳定性较差，但操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。 * * L-丙氨酸 α-酮戊二酸 α-丙酮酸 L-谷氨酸 H 草黄色 棕红色 500 500 500 500 500 2，4-二硝基苯肼 300 350 400 450 500 底物缓冲液 200 150 100 50 0 丙酮酸标准液 100 100 100 100 100 pH7.4PBS 4 3 2 1 0 加入试剂（μl） 混匀，置37℃恒温20分钟 ΔA(An-A0) A505 406 209 109 50 — 酶活力（U／L） 150 97 57 28 — 相当于酶活力KarU 5000 5000 5000 5000 5000 氢氧化钠 混匀后，室温10分钟， 505nm波长，以蒸馏水校正零点， 读取各管的吸光度值，制作工作曲线。 500 500 底物缓冲液 — 100 pH7.4PBS 100 — 血清 测定管（U） 空白管（B） 加入试剂（u1） 混匀，置37℃恒温30分钟 500 500 2，4—二硝基苯肼 混匀，置37℃恒温20分钟 ΔAU(Au-AB) A505 5000 5000 氢氧化钠 混匀后，室温10分钟，505nm波长，以蒸馏水调零点， 读取测定管的吸光度值。 （三）卡门氏单位（KarU）定义：KarU单位为分光光度单位，lml血清在25℃、反应液总体积3ml、波长340 nm、光径1.0cm时，每分钟吸光度下降0.001A为1个单位。 【注意事项】 1．酶活力大于150KarU或406U／L(37℃)，应将样品用蒸馏水 适当稀释后测定，结果乘以稀释倍数。 2．反应温度和时间必须严格按照操作规程进行控制。 3．如遇黄疸、溶血或乳糜标本时应作样品空白。 4．试剂变混浊或空白吸光度值超出0.220—0.290范围应弃去。 5．试剂在2～8℃密闭避光贮存可稳定12个月。 6. 加入2，4 –二硝基苯肼溶液的作用： ① 终止酶促反应。 ② 显色反应。