选修一5-3血红蛋白的提取和分离分析.pptVIP

我们可从鸡血中提取得到DNA，DNA到底有着怎样的特性？ 假如想提取得到蛋白质（如血红蛋白），我们能成功吗？蛋白质有没有什么特性呢？该用什么动物的血呢？ 课题3 血红蛋白的提取和分离 一. 蛋白质分离的原理和方法 1、蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性（理化性质）的差异： 分子的形状、大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 对其他分子亲和力 来分离不同种类的蛋白质。 凝胶色谱法：又称分配色谱法 电泳法 2、蛋白质提取和分离的方法： （一）凝胶色谱法 1、概念： 也称分配色谱法，根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2、凝胶的基本知识： 凝 胶 形态： 组成： 结构： 微小多孔的球体 大多是由多糖类化合物形成 如葡聚糖、琼脂糖 内含许多贯穿的通道 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小 相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶 内部的通道 在凝胶外部移动 路程较长 移动速度较慢 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 3．凝胶色谱法的原理 调节缓冲剂的 就可以制 得在 使用的缓冲液。 通常由 种缓冲剂溶解于水 中配制而成的溶液。 1．缓冲溶液：（ 1．什么是缓冲溶液？） 1～2 2．缓冲溶液的作用：（2．缓冲溶液的作用是什么？） 3．缓冲溶液的配制：（3．缓冲溶液是如何配制的？你所学过 的人体血浆缓冲物质有哪些？） 在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持溶液pH基本不变。 使用比例 不同pH范围内 （二）缓冲溶液- 可做洗脱剂 使用的是20mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲液。 目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）。 4．血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲溶液：（4．在血红蛋白的提取和分离实验中用的 缓冲溶液是什么？它的目的是什么？） 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 （三）电 泳 1、概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： ◆ 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 ◆ 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具 有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带 上正电或负电。 ◆ 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 + + + + + + + + 电泳原理图解 凝胶电泳原理示意图 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 .聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过程： 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理： （2）粗分离： （3）纯化： （4）纯度鉴定： ↓ ↓ ↓ （一）样品处理 水 分 固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 血液的成分 血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 血红蛋白的特点： 1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固 血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色 （1）步骤： 柜式离心机 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 在蒸馏水和甲苯作用下搅拌，红细胞破裂释放 2 、血红蛋白的释放： 蒸馏水的作用是： 加入甲苯的作用是： 充分搅拌的目的是： 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 搅拌器转子 磁力搅拌器 搅拌器正在工作 高速离心 3.分离血红蛋白溶液： 2000r/min 去除脂溶性沉淀层 (分层) 分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体 滤纸过滤 分液