16SrDNA的提取纯化及测序.docVIP

3.6 16S rDNA的提取、纯化及测序 3.6.1 基因组DNA的提取与纯化 （1）摇菌过夜30℃、180r/min摇床振荡培养8~12h； （2）沉淀菌体，取菌液于1.5mL EP管中5000r/min离心5min，无菌水洗涤1~2次； （3）400μL TE重悬菌体，加入20μL溶菌酶（50mg/ml），37℃过夜； （4）加400μL CTAB提取液，轻轻摇匀，65℃水浴40min（每10min轻摇一次）； （5）冷却至室温，加400μL酚-氯仿 1:1 ，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min； （6）吸取上层清液，加400μL氯仿，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min； （7）吸取上层清液，加入等体积冰冻异丙醇，轻轻摇匀，-20℃静置30min~24h沉淀DNA，12000r/min，4℃离心20min； （8）小心倒掉水相，75%乙醇洗涤2次，风干。 （9）200μL TE溶解沉淀，加入20μL RNA酶（20mg/ml），37℃保温30min，以等体积的酚-氯仿和氯仿各抽提一次； （10）吸取上清液，加入1/10体积3mol/L NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀至出现絮状沉淀，1000r/min离心30min； （11）倒掉上清液，用75%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干。加入20~30μL TE缓冲液，-20℃保存待用