中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)实验室检测介绍.pptx

中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测 参考标准 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术指南 WHO: Laboratory?Testing for Middle East Respiratory Syndrome?Coronavirus：interim?recommendations (revised)?. (September?2014? ） US CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Patients Under Investigation (PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) - Version 2 MERS-CoV感染标本采集对象 中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例； 其它需要进行MERS-CoV感染诊断或鉴别诊断者。 标本采集要求 从事MERS-CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训，培训合格且具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员进行安全防护。 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。 密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。 采集标本种类和要求 呼吸道（上、下呼吸道）和其他样品（血清、尿液和粪便）、尸检标本。 每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本，下呼吸道标本最佳，建议同时采集粪便和尿液标本。 应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否感染，双份血清样品间隔14~21天采集比较理想，第一份血清应在发病第一周内采集。但单份样品的检测对于确定疑似病例也有价值，如果只能采集一份样品，应该在出现症状后至少14天采集。 标本的保存 样品采集后应尽快送至实验室，运输过程需合理。 若呼吸道样品72小时以上才能到达实验室，强烈推荐将样品储存在-80℃并使用干冰进行运输，应避免样品反复冻融。 从全血分离的血清应4℃储存并运输，或用干冰、液氮冷冻并运输。由于无霜冰柜温度波动较大，应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品。 院内转运时，标本应该放置在耐用、防渗透的二级容器中进行转运。为减少任何标本破、漏的风险，不要使用任何气动传输系统来转运任何可能疑似患者标本。 转运至CDC的MERS-CoV标本应该充分包裹，转运时不能开盖或分装标本。标本转运应该符合三重包装系统要求：内层是主要的容器（一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料），第二层是防水、防渗漏的容器，外层是用于转运的包装。 MERS-CoV感染标本包装和运输 　 MERS-CoV感染实验室检测方法 核酸检测：为目前早期诊断、早期发现MERS-CoV感染病例的主要检测方法，采用Real-time PCR 进行病毒核酸检测和诊断，患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸，可确诊MERS-CoV感染 。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。 抗原抗体检测: IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体 间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体 利用假病毒进行中和抗体检测 MERS-CoV的实验室检测靶标 目前病毒核酸的检测方法主要有：检测E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四种。 这些方法均高度敏感，推荐upE检测用于初筛;检测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感，但比其更加特异;N2基因检测具有较高的灵敏性。 另外，已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白（N）基因的几个适合测序验证的靶序列。 巢式PCR 普通PCR PCR产物电泳或测序 逆转录，获得cDNA 核酸提取 标本采集 PCR检测 荧光定量 PCR 实验方案 待检样品 upE 特异性RT-PCR检测 阳性 阴性 ORF1a RT-PCR检测 阳性 阴性 确 诊 RdRp测序或N 测序 阴性 抗原检测 抗体检测 病毒分离 阳性 实验流程 upE upE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3 upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGACCCATA-3 upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3 ORF1b ORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3 ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3 ORF1b-Prb