第一步分离菌.docVIP

红树林海洋细菌的分离 实验材料： 分离培养基 M1培养基：可溶性淀粉0.25%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，β‐甘油磷酸钠0.01%，琼脂粉2.0%，人工海水1L，pH值7.2~7.4 2216E培养基：Yeast extract 1g，Peptone 5g，FePO4 0.01g，Agar 20g，人工海水1L， pH值7.2~7.4 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，人工海水1L，pH值7.2~7.4 称量（除琼脂外的药品）→溶化→调pH值→加入琼脂→分装→灭菌（121℃,20min）→倒平板 实验步骤： 样品处理 海泥：用50ml无菌人工海水将5g左右的海泥无菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用。 树根﹑树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3次, 75%酒精浸泡3min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用。 2．样品稀释液的制备 分别吸取500μl处理好的各种海泥、树根及树皮等样品的样液，注入盛有4.5ml，无菌人工海水的小试管中，吹吸多次，使充分混匀，然后从此小试管吸取500μl样液注入另一支盛有4.5ml无菌人工海水的小试管中，以此类推，制成10-3,10-4,10-5各种稀释度的样液。 细菌的分离培养 吸取100μl稀释为10-3,10-4,10-5稀释度的样液涂布在M1培养基、2216E培养基、牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌，并注明稀释度。放于培养箱倒置培养，28℃,2~3d。 3．记录分离到的单菌落。 红树林海洋放线菌的分离 实验材料： 分离培养基 改良高氏1号琼脂培养基 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1000ml，pH7.2～7.4，121℃灭菌30分钟。 改良的HV培养基 淀粉1g，硝酸钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，氯化钾1.7g，MgSO4?7H2O 0.05g，FeSO4?7H2O 0.01g，碳酸钙0.02g，硫胺素0.5mg，核黄素0.5mg，肌醇0.5mg，生物素0.25mg，维生素B6 0.5mg，烟酸0.5mg，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1L，pH值7.2~7.4, 121℃灭菌30分钟 改良的GA培养基 葡萄糖10g，牛肉膏1g，磷酸氢二钾0.5g，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1L，pH值7.2~7.4,115℃灭菌30分钟 Waksman蛋清蛋白培养基 蛋清蛋白0.25g 用0.1N NaOH数毫升溶解 ，琼脂20g，FeSO4?7H2O 0.01g，MgSO4?7H2O 0.2g，葡萄糖1g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1000ml，pH值6.8~7.0，121℃灭菌30分钟 实验步骤 5． 样品预处理 样品悬浮液的直接制备 海泥：用50ml无菌人工海水将5g左右的海泥无菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用。 树根﹑树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用。 ②SDS法处理 分别称取2g样品 根和皮用无菌剪刀剪碎 ，加到20ml含有0.05%的SDS（5mmol/L磷酸盐缓冲液配制）和6%酵母膏的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用 ③CaCl2法处理 分别称取2g样品 根和皮用无菌剪刀剪碎 ，加到20ml含有1g/L氯化钙的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用 ④苯酚法处理 分别称取2g样品 根和皮用无菌剪刀剪碎 ，加到20ml含有1.5%苯酚的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h 28℃,200r/min ，备用 ⑤湿热法处理 取直接制备好的样品悬浮液10ml55℃水浴6min，备用 稀释涂布 a.用移液枪吸取500μl处理好的样品悬浮液，注入另一盛有4.5ml无菌