第5章目的基因获得总结.pptVIP

(3)显色反应选择法(α-互补法) 将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。 α 互补的检测 或?-半乳糖苷酶法 4.2 PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。 4.3 菌落原位杂交法 （colony in situ hybridization） ●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。 ◆将重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与少量培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。 ◆将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，用标记的探针与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。 ◆与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号的位置，找出培养皿中所对应的噬菌斑，培养，制备DNA。 菌斑杂交法筛选λ噬菌体核基因库 菌落杂交技术寻找目标DNA克隆 4.4 免疫筛选法 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 （三）基于PCR的基因克隆 基于PCR的DNA克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。 PCR反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间。 PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的DNA。 对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的DNA样品，PCR扩增仍可获得目的基因克隆 同源克隆 原理： 以DNA变性复制的某些特性为原理，以目的DNA片段为模板, 利用酶促反应（Taq酶），在特定引物的引导下，将加入的4种dNTP由引物沿模板从5’→3’按碱基配对原则, 形成与模板DNA互补的半保留复制链, 新合成的链又可作为下一轮循环的模板。经25-30个循环产物呈 2n指数扩增，由pg—μg（紫外可见），可获得基因片段 （1） 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知） → 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的基因 （2） 构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→ 构成PCR－cDNA文库筛选 （四） 人工合成基因 ◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。 ◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段。 计算机克隆 计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。 (五)限制酶切除 （1）从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 限制酶直接切除 ①已知物理图谱 得到相关基因图谱 ②未知物理图谱 大小不同DNA片段混合物→插入载 限制酶部分消化 体→筛选阳性克隆 注①部分消化－控制酶量以及反应时间，只能切断DNA中部分位点（即部分消化）目的是为了得到大大小小的DNA片段，以免所需基因被切断失活。 ②不同的酶在DNA上识别切割顺序不同，用同一种酶可能将所需DNA片段切断失活，换上另一种酶就可能得到所