基因克隆载体构建和转化.pptVIP

基因克隆,载体构建和转化 1.基因克隆 2.连接到测序载体 3.连接到表达载体 4.转化农杆菌 5.转化植物 6.阳性植株筛选和鉴定 1.基因克隆 PCR:低温操作 模板: cDNA或基因组DNA, 可调.注意换枪头,样品间不能污染 引物: 1ul /12.5ul体系, 上下游引物混合, 分装 PCR预混液:10ul PCR程序: 根据要扩增的长度调整: 退火温度(52-68度) 延伸时间:rTaqase: 1kb/分钟 其它酶略长 PCR仪:要登记, 正确操作, 用完关掉电源,拔下电源插头或关掉插排电源, 盖子半盖, 盖上罩子 PCR预混液(10ul),分装,-20度保存 H2O Buffer：完全化开，分装 dNTP: 低温化开，分装 rTaqase:最后加,低温存放,混匀(用枪头) （因有甘油，酶常存在底部） 电泳检测: 6－10ul 上样即可 加Maker（3ul）：分子量是否正确 是否有非特异条带(若有,提高退火温度) 电泳及凝胶成像系统操作: 电泳缓冲液倒入专门的广口瓶内 制胶板, 梳子要及时清理 凝胶成像系统操作区为非污染区,勿污染 扫胶后立即关掉紫外灯 图片保存后关掉凝胶成像仪开关 最后 关掉电脑 2.连接到测序载体并转化大肠杆菌 连接:按照试剂盒说明操作 连接buffer要分装 连接buffer要完全融化再用 可在4度冰箱接着连接1-3天 转化大肠杆菌感受态细胞: 感受态细胞要在冰上融化,上下颠倒混匀 加样在超净台上进行,加样混匀要上下颠倒,不能用枪头混. 42度 热击 温度时间要严格,用温度计标温度. 含Amp 的LB平板上加X-gal, IPTG时,将IPTG加在X-gal上涂平,放在超净台上 最后涂平板时一定要涂匀,并等到表面干燥后再用封口膜封好,倒置培养,37度,12h左右. 阳性菌落的鉴定 挑选白色菌斑,重新在新的LBA平板上划线培养12h左右. 在超净台上用白色枪头挑去微量菌落加入PCR混合物中,进行PCR鉴定 程序同上, 30循环,退火温度降低 质粒PCR 选2-3个菌落PCR鉴定出的菌落 5-6ml LB 液体培养基(加Amp,1000倍母液)过夜, 37度培养. 在超净台各取1ml菌于1.5ml 无菌离心管内于4度保存 同时取0.5ml菌液,加入0.1ml无菌甘油,混匀,-40或－80度保存. 剩余菌液用于提质粒, 用质粒做模板,进行PCR鉴定 注意：菌种的标记（标签纸） 测序载体：pMD－at1392 pMD－RGT 表达载体：pBI121－RGT－E（E.coli） 转化农杆菌：pBI121－RGT－A（ Agro bacterium tumefaciems ） 质粒提取: 用前先检查药品和柱子是否够用 检查相应试剂状态 加Rnase 加乙醇 澄清 离心前平衡** 水域锅用完关掉** 测序 选出能通过质粒PCR扩增出的菌液(4度保存,当天送样测序), 用封口膜封好, 填好测序单, 送样测序, 保存好存根. DNA限制性内切酶消化酶切 双酶切 酶切buffer: 平衡两种酶 酶切温度: 酶切时间: 酶切效率 酶切体系: 1ul酶/20ul体系 酶切后电泳,回收 电泳:更换新的电泳缓冲液 胶: 浓度低的胶,厚,上样量尽量多 切胶:选准片段, 快,减少紫外注射的时间 切胶:尽量去除多余的无样的胶 回收： 胶要充分溶解， 注意:EB污染手,枪等 用20-25ul 两次冲洗,共得到20ul左右 电泳:3－5ul上样，加相同量的Maker,确定浓度 反应必须于16℃进行。 当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。4度延长连接时间。 如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？ 连接前使用碱性磷酸酶，去除载体5’端的磷酸抑制质粒的重新环化。 调节外源DNA 和克隆载体的比例 平末端：PEG 拟南芥转化，筛选 侵染： 收种子：2－3次 筛选：收完及时筛选 * * 若能扩增出分子量正确的单一条带: 1) PCR循环调为26-28个 2) 模板量增加 3)更换保真性高的的Taqase, 如:LATaq (扩增长度1kB以上) Pfu Taq (保真性最高,但需要加尾) 取6ul电泳检测,剩余-20保存, 连接用 若用Pfu 酶,则需要加尾 如何做酶切反应？ 正确使用和保存酶: 酶需要保存在-20度的低温环境中，只是