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PCR常识问答 ——写给自己的PCR教程 1、什么是PCR（聚合酶链反应）？ 答 体外模拟体内进行DNA复制反应特异扩增一段已知序列的DNA片段过程。每一次复制包括变性、退火和延伸。 2、PCR是谁发明的？ 答 美国人Kary Mullis 3、一个PCR体系包括哪些？ 答 模版、特异性引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、二价阳离子 Mg2+ 、缓冲液等 4、模版要求有哪些？ 答 DNA、尽量纯、长度宜短、一般用核酸蛋白检测仪检测A280/A260，纯度和浓度达标再进行后面的步骤，否则需进行进一步的纯化，当然如果对结果仅快速初略检测可以降低要求，具体看实验目的。 5、引物要求有哪些？ 答 上下游引物配对，GC含量40%—60%，各种碱基分配均匀；18-25个寡核苷酸长度，上下游引物长度差别不超过3个；不能有自身互补序列，上下游引物间 3个寡核苷酸的反相互补序列，尤其是3＇端不能结合到另一引物上；两引物Tm值相差尽可能小，一般不能超过5℃，扩增产物于引物Tm值相差＜10℃；3＇端尽可能为G或C，但不出现重复的CG相连。 50ul反应体系中上、下游引物浓度一般均为0.1-0.2umol/L，条件需要优化。 6、热稳定DNA聚合酶有哪些？ 答 50ul反应体系1-2U聚合酶，分装-20℃保存，随用随取， 7、dNTP要求有哪些？ 答 4种脱氧核苷三磷酸要等摩尔混合物。50ul反应体系一般200-250umol/L，最好优化浓度，市购体系组分记得分装-20℃密闭保存。 8、二价阳离子要求有哪些？ 答 常用Mg2+，要浓度优化。一般在1.5mmol/l左右。记得要分装哦，要求密闭保存。 9、缓冲液要求有哪些？ 答 一般为Tris-Hcl，浓度一般10-50mmol/L，反应体系pH一般8.3-8.8。最好购买现成的，自己配置太麻烦。也要分装，密闭保存。 10、为什么要分装？ 答 购买的PCR体系组分一般不适合反复冻融，反复用大瓶的反应体系拿来实验增加污染机会，一旦污染导致的是整大瓶试剂报废，且在出现异常结果时不易找到问题所在（分装试剂可以换小支继续重复实验）。唉，实验经费有限啊，经不起报废啊。分装原则一般为略多于够5支50ul反应体系用为佳，分的支数太多了浪费试剂，分的太少了和没分装差别不大。大规模实验前要记得进行小规模的预实验哦，一方面摸索最佳的反应条件另一方面节约经费，不然一下子上大规模的实验如果效果不佳就浪费大量试剂，这可是RMB啊，咱小研究员可经不起这种折腾。 11、什么是浓度优化？ 答 当某一组分浓度大小影响实验结果时就应当进行优化，其实就是固定其他组分浓度和反应条件固定，该组分浓度设计梯度浓度（比如设计1mol/L、21mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L进行反应），一般预实验时做5-10梯度，初步确认好浓度，然后确定其他组分最佳浓度，最后可以适当微调整各组分浓度达到最佳的各组分浓度配比。 12、PCR反应条件是什么？ 答 一般95℃变性45s，72℃延伸，低于引物 Tm5℃左右的退火温度。要是引物中有较多GC碱基或引物片段过长，可以设计两步95℃变性，Tm-72℃间选择一温度进行退火-延伸步骤，但效果不佳，需加大酶量，一般不推荐使用。亲，所有的步骤所需的时间均需优化哦，每步反应温度其实同样要优化的（理论和实际的差别很大的，相信推荐浓度有时会害了自己的）。一般还在正式循环前加入5min左右的预变性阶段，正式循环后4℃长时间保存。循环次数一般在20-40.一般在30循环左右进行优化。 13、PCR产物检测方法有哪些？ 答 反应产物加DNA Marke行电泳，琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的缓冲液和电泳的电压及电泳时间要优化，测序，强烈建议买一本《新编分子生物学实验指南》。DNA Marker要有目的条带附近的指示条带，选择时要看看每个Marker的尺度，选择时要多方面综合考虑。 14、琼脂糖电泳操作是怎么样？ 答 琼脂糖凝胶浓度和合适的分离DNA片段大小见图一。孔径越大分离的片段也大些。 表一DNA浓度与合适的琼脂糖浓度 琼脂糖（%） DNA片段大小（kb） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 30-1 12-0.8 10-0.5 7-0.4 3-0.2 注：琼脂糖%指琼脂糖重量（g）比配制胶缓冲液的体积（ml），一般在制胶时在冷却56℃左右时加入0.5 ug/ml的溴化已锭（EB），一般1-2ul就够。 15、提取DNA最好用什么采血管？ 答 病毒如血中乙肝病毒可以用红色分离胶血清管，提取EB病毒要紫色EDTA抗凝管。 提取细菌真菌还是EDTA抗凝管比较好，肝素管是会影响PCR反应的哦，所以最好不采用，顺便说下检测样本来源，其实还要考虑下目标细胞在哪个部位、哪种体液、哪个组织中最多，这样