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第五章  大肠杆菌克隆策略 第一节  克隆基因组DNA 基因组文库 文库法克隆 将所研究生物材料的所有DNA不加选择地分离成若干易于处理的片段，并全部克隆的研究方式。这样一个克隆的集合代表了整个起始材料的DNA，称为文库。依据文库的DNA来源与组成形式可以分为基因组文库（来源于基因组DNA)和cDNA文库(来源于转录组的逆转录）。 选择性克隆 有选择性地克隆某一基因或某一组基因的DNA片段。 以λ噬菌体载体克隆基因组文库 以某一种特定限制性内切酶(如EcoR I)对全长基因组DNA进行消化，将得到的片段插入到合适的λ噬菌体载体中，并转入大肠杆菌，以噬菌斑的形式保存与琼脂平板上。 以这样的文库为基础，再筛选出感兴趣基因的克隆。 以λ噬菌体载体克隆基因组文库，可能存在的问题 以EcoR I酶切为例，EcoR I在人类基因组中平均每4kb出现一次酶切位点 限制性酶切可能在所研究的基因内部切割一次或多次，这样可能得不到完整的单个基因片段。 当希望得到基因侧翼扩展区域(上、下游区域，如启动子序列等)，4kb的片段显得过小，操作很不方便。 当片段大小大于载体接受范围(20kb),片段不能被克隆，会造成丢失。 解决方法： 对于前两者，通过筛选拼接可以解决。 对于后者，希望进行切割时能得到符合大小要求的片段。 衔接物连接法 衔接物连接法 解决了得到合适大小的DNA片段与连接入载体之间的便利性之间的矛盾。 所得的只是一个近乎完整的文库。 具体方案： 用两种识别4个核苷酸的酶HaeIII和Alu I对DNA进行部分限制性切割，在进行分子大小分选，从而得到一系列大约20kb的片段。 在这一系列片段两端加上EcoRI接头分子，以方便连入载体。 EMBL3A载体的使用 EMBL3A载体的使用 EMBL3A载体的优点 采用单一限制性酶酶切基因组DNA更为方便 运用了Sau3A I和BamH I可以相同粘末端的特性 具有Spi- 表型，便于筛选。 如果λ 噬菌体缺少两个参与重组的基因red 和gam ，同时带有chi 位点，并且宿主菌为rec + ，则可以在P2 溶源性E.coli 中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi- 表型。 高容量载体在基因组文库构建中的运用 λ噬菌体载体对于插入片段的限制性，限制了其在较大真核基因组文库构建中的使用 Cosmid、YAC、BAC、PAC等能插入更大片段的载体被使用 第二节 cDNA文库 cDNA文库的构建 cDNA远小于基因组，且不用进行酶切分成小片段 cDNA克隆在某一种转录组内，很容易得到完整的文库 cDNA文库更能反映一个生物材料的功能特性，因此能够进行功能性的差异分析 cDNA文库构建 利用质粒载体克隆，方便但不利于长期保存 常利用λ噬菌体载体进行克隆 利用oligo dT作为引物反转录得到cDNA 全长cDNA文库构建：cDNA末端快速扩增(RACE) 第三节 文库筛选策略 要鉴定文库中一个特定克隆需要进行文库筛选 通过克隆序列筛选： 1）核酸杂交 2）PCR 通过克隆表达产物的结构功能筛选 1）配体相互作用筛选：免疫、核酸-蛋白质、其他配体相互作用 2）功能筛选：直接检测表达蛋白功能、依靠功能互补实验筛选 核酸杂交筛选 利用同源探针进行筛选 探针可能不严格配对(具有兼并性） 核酸杂交筛选的一般步骤 DNA印迹： 1) 转膜 2) 形成DNA印迹： 碱裂解细菌、降解蛋白、固定 阳性菌落显影： 3) 探针杂交 4) 显影 5) 对照母板找出阳性克隆 核酸杂交探针与PCR筛选引物的兼并性设计原则 以同源基因序列的特征为依据 尽可能的选用保守性较好的区域来进行设计，也就是要具有一定的严格性 需要适当的保留一些兼并性，对于一个18个碱基的PCR引物，保留3-4个碱基的兼并性往往是需要的。 免疫筛选 利用表达蛋白与其抗体的抗原-抗体结合特性，进行筛选 依靠功能互补实验筛选 功能互补实验，是指特定DNA序列弥补突变细胞的缺失功能，进而恢复野生型表型的实验过程。 第四节 差异克隆 差异克隆 差异克隆，是指用于分离某一特定材料中特异存在的序列的技术，通常是指差异表达性的cDNA。 原理： 1) 显示两种材料之间的差异，以确定差异表达的克隆；(差异显示) 2) 运用差异来产生富含差异表达序列的一群克隆。(差异富集) 差异克隆 差异显示 差异基因绝对有无的显示(通过序列分析研究) 1) cDNA文库测序 2)基因表达系列分析(SAGE,Serial analysis of gene expression) 差异基因相对量的显示(通过PCR或微阵列分析研究) 1) 差异显示PCR 2) DNA