microRNA详解.ppt

* microRNA基因组分布 60%独立表达 15%成簇表达 25%的miRNAs位于内含子 * 植物与动物miRNA的区别 动物 植物 前体茎环结构 短，简单 长，复杂，折回长度变异明显 加工过程 先在细胞核，后在细胞质 仅在细胞核中 作用机制 大部分作为翻译阻遏子，小部分导致靶mRNAs降解 大部分介导靶mRNAs的降解 长度 22-23nt 21nt 保守性 高 更高 * miRNP与RISC 都是一种核糖核蛋白（RNP）; 二者的大小相近, miRNP约550 kDa, RISC约500 kDa; 都含有PPD蛋白(人的miRNP含有EIF2C2，是一种PPD蛋白，果蝇的RISC 中也含有PPD蛋白AGO-2)。 PPD蛋白：具有PAZ和PiWi两个结构域的蛋白。 * 应用领域 疾病治疗 miRNA 干细胞研究 病毒研究 肿瘤研究 植物研究 动物研究 * microRNA与肿瘤研究 肿瘤发生：miRNA能作为肿瘤抑制剂或致癌因子行使功能，特定miRNA的敲除或过表达可用于研究miRNA在癌症发生和发展过程中的作用； 近年发现50％以上的miRNA 基因定位于肿瘤相关的染色体座位或其脆性位点，直接或间接导致了肿瘤的发生。 肿瘤诊断：正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明显改变，这些特点使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标； 慢性淋巴细胞白血病(CLL) 中miR-15a和miR-16-1存在缺失或下调。 癌旁组织相比，癌肿组织的miR一122表达是下降的。 肿瘤治疗：由于大多数致癌基因能够引发癌症，因而可以设计一些人造miRNA阻碍其表达，从而达到抑制癌症形成的目的。 体外实验表明，let-7对多种人类肺癌组织有明显抑制作用，移植到小鼠肺癌模型中，let-7 作为鼻内药物能减少小鼠肺癌模型的肿瘤形成。 * miRNA与干细胞研究 miRNAs在干细胞的自我更新、未分化状态的维持、继续分化增殖都有重要的调控作用。 将miRNAs作用与转录因子调控和表观遗传调控等相结合，有助于全面了解干细胞自我更新和多向分化潜能的分子机制。 * miRNA与病毒研究 miRNAs可以通过与病毒的靶mRNA结合，从而灭活RNA病毒； 宿主细胞编码miRNA对抗病毒感染的同时，病毒本身的基因组也可以编码自己的miRNA攻击宿主细胞的防御系统； * miRNA与植物研究 miRNAs可以调控植物生长发育；如miR166能与转录因子ATHB15 mRNA结合并直接切割，调节维管植物中维管组织的发育； 介导植物对病毒、病菌的抗性； 调节植物对环境的耐受胁迫，如抗旱、抗盐、抗严寒等。 * miRNA与动物研究 miRNAs可以调控动物生长发育； 介导动物细胞的增殖与凋亡； 调节激素的分泌。 * miRNA的作用是多种多样的，它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用，形成调节环与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。 大多数miRNA并非独立作用，而是参与到复杂的基因调控网络； * 回收< 200 bp的小分子RNA Ambion公司：mirVana miRNA Isolation Kit RT-PCR qPCR Northern Blot * 利用人工microRNAs对拟南芥DUF647家族基因的特异沉默 DUF647 (Domain of unknown function)基因家族是拟南芥基因组中一个功能未知的基因家族,由基因AT1G13770、AT2G23470、AT2G31190、AT3G45890、AT5G01510和AT5G49820组成。 EMS诱变筛选已获得了基因AT2G3l 190和AT3G45890的突变体 研究目标：试图通过人工微小RNAs (artificial microRNAs, amiRNAs)基因沉默技术得到这4个基因敲除的突变体 * 利用人工microRNAs对拟南芥DUF647家族基因的特异沉默 设计靶向基因的amiRNAs； 重叠PCR合成含有所设计amiRNAs序列的amiRNA前体； 将前体序列构建到植物表达载体，农杆菌转化法转入拟南芥； 卡那筛选 PCR检测确认基因组中含有amiRNAs； RT-PCR检测到靶基因表达下调的转基因株系，表现出了明显的突变表型； * * 非编码RNA 真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-coding RNA),在真核生物中发挥重要作用： 一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。 miRNA大小为19~25 nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控、生长发育中起重要作用。 siRNA在RNA干扰(RNA